微生物分子育种技术
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思考题：
1、重组DNA技术？
2、定向进化技术？ 3、DNA重排技术？ 4、基因组重排技术？ 5、代谢工程？
第十章
微生物分子育种技术
重组 DNA 技术的发展从根本上改变了生物技术的研究 和开发模式。 可以直接地、有针对性地在 DNA 分子水平上改造生物 的遗传性状。 通过转人外源基因，微生物和动植物细胞可以产生出自 身原来没有的蛋白质。 同样，利用重组 DNA 技术，也可以使一些原来存在量 极低的、但有重要工业或医学用途的小分子或蛋白质之外的 大分子物质得以大量生产。 微生物生长迅速、培养成本低成为理想宿主。
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
2 DNA连接酶 与 DNA分子的体外连接 带有非互补戮性末端的片段（找相应的酶）
带有相同薪性末端的片段（防止自环化）
带有平末端的片段（效率不高）
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
3 DNA 聚合酶与 PCR 技术 DNA连接酶的作用是体外实现DNA的“复制”过程。 PCR 是聚合酶链式反应的简称，是一种体外决速扩增特定 DNA 片段的技术。
细胞中特定的生化反应或引入新的生化反应，以提高特定
代谢物的产量或改善细胞的其他性能的方法。
随机诱变。
3、DNA重排，将同源DNA随机切成小片段后用PCR进行重聚以 得到大量重组DNA的育种方法。 （随机）
第十章 第三节 基因组重排
基因组重排技术：
第三节
利用多亲本同时进行原生质体融合产生大量随机融合子，
ຫໍສະໝຸດ Baidu
从融合子中挑选需要方向特性的育种方法。
第十章 第四节 代谢工程
第四节
代谢工程： 又称为途径工程，或代谢设计，是利用DNA重组技术修饰
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
为了在分子水平上对 DNA 进行人工切割和拼接等操作， 需要采用一系列重要的酶作为工具。 一般把这些用以进行 DNA 分子切割、片段修饰和连接等 重组操作的酶称为工具酶。 重组 DNA 技术涉及的工具酶种类繁多、功能各异。限制 性核酸内切酶、 DNA连接酶、反转录酶、 DNA聚合酶等
甲基化修饰酶功能，条件简单。
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
2 DNA连接酶 与 DNA分子的体外连接 DNA连接酶的作用是催化双链 DNA 缺口处相邻的两个脱
氧核昔酸残基连接。
常用的 DNA 连接酶有两种： 大肠杆菌编码的 DNA连接酶（黏性末端）
大肠杆菌T4噬菌体编码的 T4DNA连接酶（黏性、平末端）
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
4 其他工具酶 重组 DNA 技术中还经常用到反转录酶、末端脱氧核昔酸 转移酶、 T 4多核昔酸酶、碱性磷酸酶、核酸外切酶和单链核 酸内切酶等。
第十章 第一节 重组DNA技术
3 外源基因的获得
1、DNA文库或cDNA文库（真核的mRNA逆转录得到），需要筛 选确定；
第十章
1.
微生物分子育种技术
目录 重组DNA技术
2．酶的定向进化
3．基因组重排
4．代谢工程
第十章 第一节 重组DNA技术
1 重组 DNA 技术的基本过程
重组DNA技术：
第一节
是将一个含有目的基因的DNA片段经体外操作与载体连接， 并转入到受体细胞，使之在受体细胞内扩增、表达的操作过 程。
第十章 第一节 重组DNA技术
1 重组 DNA 技术的基本过程
重组 DNA 技术的基本过程： ① 含目的基因的 DNA 片段的分离与制备； ② 载体的构建； ③ 含目的基因的 DNA 片段与载体相连接； ④ 将重组分子送人受体细胞，并在其中复制、扩增；
⑤ 筛选带有重组 DNA 分子的转化细胞；
⑥ 鉴定外源基因的表达产物。 四个必要条件：工具酶，基因，载体和受体细胞。
2、DNA的人工合成（引物或者大片段的不连续合成）
3、PCR扩增（目标DNA两端设计引物扩增出来）
第十章 第一节 重组DNA技术
4 载体-宿主系统
获得的DNA需要与媒介（类似噬菌体、质粒）“重组” （人工拼接）后，进入“宿主”（生物反应器或目标微生物）
表达。
其他略 DNA克隆 DNA测序
第十章 第二节 酶的定向进化
定向进化技术：
第二节 定的选择压，让目标生物向着确定的方向加速进化的育种
方法。
通过DNA重排技术等人为方法制造大量变异体，施加以确
第十章 第二节 酶的定向进化
定向进化的方法： 1、定点突变，指定位点上引人特定的碱基对变化的技术（已
知序列）。
2、易错 PCR，PCR时会以一定的频率发生碱基错配，可进行
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
1 限制性内切酶 识别和切割双链 DNA 分子内特殊核昔酸顺序的酶统称为
限制性内切酶，简称限制酶。
限制酶分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ 型。只有 Ⅱ型酶被广泛应 用于 DNA 分子的体外重组。 Ⅱ 型酶特点： ① 识别特定的核昔酸序列；② 具有特 定的酶切位点，切割后形成黏性末端（或平末端）；③ 没有
1、重组DNA技术？
2、定向进化技术？ 3、DNA重排技术？ 4、基因组重排技术？ 5、代谢工程？
第十章
微生物分子育种技术
重组 DNA 技术的发展从根本上改变了生物技术的研究 和开发模式。 可以直接地、有针对性地在 DNA 分子水平上改造生物 的遗传性状。 通过转人外源基因，微生物和动植物细胞可以产生出自 身原来没有的蛋白质。 同样，利用重组 DNA 技术，也可以使一些原来存在量 极低的、但有重要工业或医学用途的小分子或蛋白质之外的 大分子物质得以大量生产。 微生物生长迅速、培养成本低成为理想宿主。
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
2 DNA连接酶 与 DNA分子的体外连接 带有非互补戮性末端的片段（找相应的酶）
带有相同薪性末端的片段（防止自环化）
带有平末端的片段（效率不高）
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
3 DNA 聚合酶与 PCR 技术 DNA连接酶的作用是体外实现DNA的“复制”过程。 PCR 是聚合酶链式反应的简称，是一种体外决速扩增特定 DNA 片段的技术。
细胞中特定的生化反应或引入新的生化反应，以提高特定
代谢物的产量或改善细胞的其他性能的方法。
随机诱变。
3、DNA重排，将同源DNA随机切成小片段后用PCR进行重聚以 得到大量重组DNA的育种方法。 （随机）
第十章 第三节 基因组重排
基因组重排技术：
第三节
利用多亲本同时进行原生质体融合产生大量随机融合子，
ຫໍສະໝຸດ Baidu
从融合子中挑选需要方向特性的育种方法。
第十章 第四节 代谢工程
第四节
代谢工程： 又称为途径工程，或代谢设计，是利用DNA重组技术修饰
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
为了在分子水平上对 DNA 进行人工切割和拼接等操作， 需要采用一系列重要的酶作为工具。 一般把这些用以进行 DNA 分子切割、片段修饰和连接等 重组操作的酶称为工具酶。 重组 DNA 技术涉及的工具酶种类繁多、功能各异。限制 性核酸内切酶、 DNA连接酶、反转录酶、 DNA聚合酶等
甲基化修饰酶功能，条件简单。
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
2 DNA连接酶 与 DNA分子的体外连接 DNA连接酶的作用是催化双链 DNA 缺口处相邻的两个脱
氧核昔酸残基连接。
常用的 DNA 连接酶有两种： 大肠杆菌编码的 DNA连接酶（黏性末端）
大肠杆菌T4噬菌体编码的 T4DNA连接酶（黏性、平末端）
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
4 其他工具酶 重组 DNA 技术中还经常用到反转录酶、末端脱氧核昔酸 转移酶、 T 4多核昔酸酶、碱性磷酸酶、核酸外切酶和单链核 酸内切酶等。
第十章 第一节 重组DNA技术
3 外源基因的获得
1、DNA文库或cDNA文库（真核的mRNA逆转录得到），需要筛 选确定；
第十章
1.
微生物分子育种技术
目录 重组DNA技术
2．酶的定向进化
3．基因组重排
4．代谢工程
第十章 第一节 重组DNA技术
1 重组 DNA 技术的基本过程
重组DNA技术：
第一节
是将一个含有目的基因的DNA片段经体外操作与载体连接， 并转入到受体细胞，使之在受体细胞内扩增、表达的操作过 程。
第十章 第一节 重组DNA技术
1 重组 DNA 技术的基本过程
重组 DNA 技术的基本过程： ① 含目的基因的 DNA 片段的分离与制备； ② 载体的构建； ③ 含目的基因的 DNA 片段与载体相连接； ④ 将重组分子送人受体细胞，并在其中复制、扩增；
⑤ 筛选带有重组 DNA 分子的转化细胞；
⑥ 鉴定外源基因的表达产物。 四个必要条件：工具酶，基因，载体和受体细胞。
2、DNA的人工合成（引物或者大片段的不连续合成）
3、PCR扩增（目标DNA两端设计引物扩增出来）
第十章 第一节 重组DNA技术
4 载体-宿主系统
获得的DNA需要与媒介（类似噬菌体、质粒）“重组” （人工拼接）后，进入“宿主”（生物反应器或目标微生物）
表达。
其他略 DNA克隆 DNA测序
第十章 第二节 酶的定向进化
定向进化技术：
第二节 定的选择压，让目标生物向着确定的方向加速进化的育种
方法。
通过DNA重排技术等人为方法制造大量变异体，施加以确
第十章 第二节 酶的定向进化
定向进化的方法： 1、定点突变，指定位点上引人特定的碱基对变化的技术（已
知序列）。
2、易错 PCR，PCR时会以一定的频率发生碱基错配，可进行
第十章 第一节 重组DNA技术
2 工具酶与相关技术
1 限制性内切酶 识别和切割双链 DNA 分子内特殊核昔酸顺序的酶统称为
限制性内切酶，简称限制酶。
限制酶分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ 型。只有 Ⅱ型酶被广泛应 用于 DNA 分子的体外重组。 Ⅱ 型酶特点： ① 识别特定的核昔酸序列；② 具有特 定的酶切位点，切割后形成黏性末端（或平末端）；③ 没有