昆明医学院分子生物学实验的设计PPT课件
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2011级本科生化及分子生物学实验设计
• 年级、专业、班级：2010级临床二大班
• 实验课时间：2010年4月25日
• 实验室：第四实验室
• 组别：第四组
• 组员排名：PPT制作及演讲（屈再蕊、古怡）
•
wenku.baidu.com
资料查找（楼昕、蒋安罡）
• 报告人：古怡、屈再蕊
--
1
实验名称 高铁血红蛋白还原实 验
实验目的
• 掌握高铁血红蛋白还原实验的 操作及步骤
• 了解G6PD的活性检测
--
2
实验原理
• 正常红细胞的G6PD能使6磷酸葡萄糖转变为6磷酸葡萄 糖酸，同时又能使其辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸(NADP+)还原为还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)，高铁血红蛋白在NADPH供氢条件下还原成还 原血红蛋白。氧化型亚甲基蓝可作为递氢体加速磷酸 戊糖旁路代谢中此种作用的速度，当G6PD缺乏时，在 递氢体亚甲基蓝加速磷酸戊糖旁路的条件下，高铁血 红蛋白还原速度显著降低，因此，可根据高铁血红蛋 白还原的速度来了解红细胞有无G6PD缺乏。
--
3
G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维持还原型谷胱 甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作用），在遇到蚕豆 中某种因子后更诱发了红细胞膜被氧化，红细胞膜 上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂 质，损害细胞膜。 G-6-PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新 鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G-6-PD缺乏时则红细胞 被破坏而致病。 亚甲基蓝与血红蛋白结合能力强 亚硝酸钠能使血红蛋白变成高铁血红蛋白 高铁血红蛋白还原试验意义 当红细胞G-6-PD活性正 常时，还原率>75%；如G-6-PD缺陷，形成高铁血红 蛋白，还原速度远较正常红细胞慢，还原率显著降 低。
--
4
实验试剂
• 高铁血红蛋白还原试验法试剂⋯(自制，有效期内使 用)：0．18 mo]／1 亚硝酸钠一0．28 mol／I 葡 萄糖溶液(亚硝酸钠1．25 g，葡萄糖5．o g，加蒸 馏水至100 mL，贮存于棕色瓶中，放4℃冰箱．可 保存1个月)
• 0．4 mmol／I 亚甲基蓝溶液(先将0.15 g含3个结 晶水的亚甲基蓝放入乳钵中，加蒸馏水少量研磨， 待溶解后移到100 mL容量瓶中．再加蒸馏水至100 mL，混匀过滤，此液可贮存3个月)、生理盐水、蒸 馏水。
--
10
SUCCESS
THANK YOU
2020/12/20
--
11
实验结果
• 朗伯比尔定律A=lg（1/T）=Kbc（A-吸光度， T-透射比，K-摩尔吸收系数，c-吸光物质的 浓度，b-收层厚度）
高铁血红蛋白还原率(MHb% )=(1一A／ S)×100 ，MHb%在31～74 之间(中间值，杂 合子)或≤30 (纯台子)，即为G 6PD活性缺乏， 均判断为阳性。MHb% ≥75 ，则为G6PD活性 正常，判断为阴性。
蚕豆后，随后发生的急性溶血性疾
病。通过性联不全显性遗传，G-6-
PD基因在X染色体上，病人大多为男
性，男女之比约为7∶1，在生吃蚕 豆后数小时至数日（1～3天）内突 然发热、头晕、烦躁、恶心，尿呈 酱油样或葡萄酒色，一般发作2～6
天后能自行恢复，但重者若不及时
抢救，会因循环衰竭危及生命。
--
14
3.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室
--
12
思考题
1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查， 初步判断患儿是何种疾病？（必答）
面色苍白——贫血 伴血尿——血红蛋白尿 恶心、呕吐——说明有溶血性贫血 尿呈酱油色——蚕豆病典型体征 姐姐有过类似情况——符合蚕豆病具有遗传性 这一特点
--
13
相关知识
• 蚕豆病是由于遗传性红细胞六磷酸 葡萄糖脱氢酶(G6PD酶)缺乏者进食
0.1
全血/ml
来回摇动15-20次,置37℃水浴箱静置3 h
蒸馏水／ 10.00 mL
10.00
10.00
--
9
4 颠倒混匀，以“B”管为空白管， 在波长635 nm 处测定“A”管及“ S”管吸光度。 5 高铁血红蛋白还原率(MHb% )=(1 一A／S)×100 ，MHb%在31～74 之 间(中间值，杂合子)或≤30 (纯台 子)，即为G 6PD活性缺乏，均判断 为阳性。MHb% ≥75 ，则为G6PD活 性正常，判断为阴性。
检查结果。（必答）
蚕豆病
遗传性
葡萄糖-6磷-酸脱氢酶
急性溶血性贫血
--
15
1，G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维持 还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作 用），在遇到蚕豆中某种因子后更诱发了红 细胞膜被氧化，红细胞膜上的磷脂分子中的 不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质，损害细 胞膜发生溶血。 故临床表现为黄疸，精神萎靡，低热。溶血 严重发生心力衰竭，造成食欲不振、恶心、 呕吐 这些临床症状，心衰最典型的症状是程 度不同的呼吸困难，所以病人呼吸急促。
--
16
2，还原型谷胱甘肽（GSH）是体内重要的抗 氧化剂，可以保护一些含—SH(氢硫基)的蛋 白质或酶免受氧化剂尤其是过氧化物的损害 。因G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维 持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧 化作用），高铁血红蛋白还原成血红蛋白降 低。
3，高铁血红蛋白还原率(MHb% )在31～74 之间(中间值，杂合子)或≤30 (纯台子)， 即为G 6PD活性缺乏，均判断为阳性。MHb% ≥75 ，则为G6PD活性正常，判断为阴性。
--
5
实验仪器
• 抗凝管、紫外分光光度仪、离心机、试管、 恒温水浴箱。
--
6
实验步骤
• 1 将抗凝血以1000 r／min离心沉淀1 5 min，取出．调整血细胞与血浆比侧为1：l 后再混匀。
• 2 将0．18 mol／L 亚硝酸钠一0．28 mol ／L葡萄糖溶液与0．4 mmol／L亚甲基蓝溶 液等量混合．形成混合试剂
--
17
4, 急性溶血性贫血 起病急骤、可突发寒战、高热、面色苍白 、腰酸背痛、气促、乏力、烦躁、亦可出 现恶心、呕吐、腹痛 等胃肠道症状。这 是由于红细胞大量破坏，其分解产物对机 体的毒性作用所致。游离血红蛋白在血浆 内浓度加深时，即由尿液排出，出现血红 蛋白尿，尿色如浓红茶或酱油样，12小时 后可出现黄疸，溶血产物损害肾小管细胞 ，引起坏死和血红蛋白沉积于肾小管，以 及周围循环衰弱等因素，可致急性肾功能 衰竭。
• 3 取1 5 mm×150 mm 试管3支，标明A、B、 S，按表1顺序进行操作
• 表1 高轶血红蛋白还原试验操作步骤
--
7
混合试剂 /ml
生理盐水 /ml
0.18mol/l 亚硝酸钠,0.28mol/l 葡萄糖溶液
A 0.01
_
_
B _
0.01
_
C _
_
0.01
--
8
经调整的 0.1
0.1
• 年级、专业、班级：2010级临床二大班
• 实验课时间：2010年4月25日
• 实验室：第四实验室
• 组别：第四组
• 组员排名：PPT制作及演讲（屈再蕊、古怡）
•
wenku.baidu.com
资料查找（楼昕、蒋安罡）
• 报告人：古怡、屈再蕊
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1
实验名称 高铁血红蛋白还原实 验
实验目的
• 掌握高铁血红蛋白还原实验的 操作及步骤
• 了解G6PD的活性检测
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2
实验原理
• 正常红细胞的G6PD能使6磷酸葡萄糖转变为6磷酸葡萄 糖酸，同时又能使其辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸(NADP+)还原为还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)，高铁血红蛋白在NADPH供氢条件下还原成还 原血红蛋白。氧化型亚甲基蓝可作为递氢体加速磷酸 戊糖旁路代谢中此种作用的速度，当G6PD缺乏时，在 递氢体亚甲基蓝加速磷酸戊糖旁路的条件下，高铁血 红蛋白还原速度显著降低，因此，可根据高铁血红蛋 白还原的速度来了解红细胞有无G6PD缺乏。
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G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维持还原型谷胱 甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作用），在遇到蚕豆 中某种因子后更诱发了红细胞膜被氧化，红细胞膜 上的磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂 质，损害细胞膜。 G-6-PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新 鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G-6-PD缺乏时则红细胞 被破坏而致病。 亚甲基蓝与血红蛋白结合能力强 亚硝酸钠能使血红蛋白变成高铁血红蛋白 高铁血红蛋白还原试验意义 当红细胞G-6-PD活性正 常时，还原率>75%；如G-6-PD缺陷，形成高铁血红 蛋白，还原速度远较正常红细胞慢，还原率显著降 低。
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实验试剂
• 高铁血红蛋白还原试验法试剂⋯(自制，有效期内使 用)：0．18 mo]／1 亚硝酸钠一0．28 mol／I 葡 萄糖溶液(亚硝酸钠1．25 g，葡萄糖5．o g，加蒸 馏水至100 mL，贮存于棕色瓶中，放4℃冰箱．可 保存1个月)
• 0．4 mmol／I 亚甲基蓝溶液(先将0.15 g含3个结 晶水的亚甲基蓝放入乳钵中，加蒸馏水少量研磨， 待溶解后移到100 mL容量瓶中．再加蒸馏水至100 mL，混匀过滤，此液可贮存3个月)、生理盐水、蒸 馏水。
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SUCCESS
THANK YOU
2020/12/20
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实验结果
• 朗伯比尔定律A=lg（1/T）=Kbc（A-吸光度， T-透射比，K-摩尔吸收系数，c-吸光物质的 浓度，b-收层厚度）
高铁血红蛋白还原率(MHb% )=(1一A／ S)×100 ，MHb%在31～74 之间(中间值，杂 合子)或≤30 (纯台子)，即为G 6PD活性缺乏， 均判断为阳性。MHb% ≥75 ，则为G6PD活性 正常，判断为阴性。
蚕豆后，随后发生的急性溶血性疾
病。通过性联不全显性遗传，G-6-
PD基因在X染色体上，病人大多为男
性，男女之比约为7∶1，在生吃蚕 豆后数小时至数日（1～3天）内突 然发热、头晕、烦躁、恶心，尿呈 酱油样或葡萄酒色，一般发作2～6
天后能自行恢复，但重者若不及时
抢救，会因循环衰竭危及生命。
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3.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室
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思考题
1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查， 初步判断患儿是何种疾病？（必答）
面色苍白——贫血 伴血尿——血红蛋白尿 恶心、呕吐——说明有溶血性贫血 尿呈酱油色——蚕豆病典型体征 姐姐有过类似情况——符合蚕豆病具有遗传性 这一特点
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相关知识
• 蚕豆病是由于遗传性红细胞六磷酸 葡萄糖脱氢酶(G6PD酶)缺乏者进食
0.1
全血/ml
来回摇动15-20次,置37℃水浴箱静置3 h
蒸馏水／ 10.00 mL
10.00
10.00
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4 颠倒混匀，以“B”管为空白管， 在波长635 nm 处测定“A”管及“ S”管吸光度。 5 高铁血红蛋白还原率(MHb% )=(1 一A／S)×100 ，MHb%在31～74 之 间(中间值，杂合子)或≤30 (纯台 子)，即为G 6PD活性缺乏，均判断 为阳性。MHb% ≥75 ，则为G6PD活 性正常，判断为阴性。
检查结果。（必答）
蚕豆病
遗传性
葡萄糖-6磷-酸脱氢酶
急性溶血性贫血
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1，G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维持 还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧化作 用），在遇到蚕豆中某种因子后更诱发了红 细胞膜被氧化，红细胞膜上的磷脂分子中的 不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质，损害细 胞膜发生溶血。 故临床表现为黄疸，精神萎靡，低热。溶血 严重发生心力衰竭，造成食欲不振、恶心、 呕吐 这些临床症状，心衰最典型的症状是程 度不同的呼吸困难，所以病人呼吸急促。
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2，还原型谷胱甘肽（GSH）是体内重要的抗 氧化剂，可以保护一些含—SH(氢硫基)的蛋 白质或酶免受氧化剂尤其是过氧化物的损害 。因G6PD的缺陷不能提供足够的NADPH以维 持还原型谷胱甘肽（GSH）的还原性（抗氧 化作用），高铁血红蛋白还原成血红蛋白降 低。
3，高铁血红蛋白还原率(MHb% )在31～74 之间(中间值，杂合子)或≤30 (纯台子)， 即为G 6PD活性缺乏，均判断为阳性。MHb% ≥75 ，则为G6PD活性正常，判断为阴性。
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实验仪器
• 抗凝管、紫外分光光度仪、离心机、试管、 恒温水浴箱。
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实验步骤
• 1 将抗凝血以1000 r／min离心沉淀1 5 min，取出．调整血细胞与血浆比侧为1：l 后再混匀。
• 2 将0．18 mol／L 亚硝酸钠一0．28 mol ／L葡萄糖溶液与0．4 mmol／L亚甲基蓝溶 液等量混合．形成混合试剂
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4, 急性溶血性贫血 起病急骤、可突发寒战、高热、面色苍白 、腰酸背痛、气促、乏力、烦躁、亦可出 现恶心、呕吐、腹痛 等胃肠道症状。这 是由于红细胞大量破坏，其分解产物对机 体的毒性作用所致。游离血红蛋白在血浆 内浓度加深时，即由尿液排出，出现血红 蛋白尿，尿色如浓红茶或酱油样，12小时 后可出现黄疸，溶血产物损害肾小管细胞 ，引起坏死和血红蛋白沉积于肾小管，以 及周围循环衰弱等因素，可致急性肾功能 衰竭。
• 3 取1 5 mm×150 mm 试管3支，标明A、B、 S，按表1顺序进行操作
• 表1 高轶血红蛋白还原试验操作步骤
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混合试剂 /ml
生理盐水 /ml
0.18mol/l 亚硝酸钠,0.28mol/l 葡萄糖溶液
A 0.01
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经调整的 0.1
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