流式细胞术概述

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（三）自发荧光
• 自发荧光：未经荧光标记的细胞受到激光照射后所发 出的荧光。 • 每种细胞群都有不同水平的自发荧光，如淋巴细胞、 中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。 • 自发荧光易引起信号干扰，出现假阳性结果，在实际 临床检验工作中应注意区别。
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第三节 FCM的检测分析方法
• 流式细胞仪测定样品时，针对每个细胞都会记录 各个光电器件所采集的检测信号，这些信号经过 模/数电路Hale Waihona Puke Baidu换后，全部结果传输到计算机中存储 并分析。目前所使用的流式细胞仪为了对获取的 数据更直观地进行观察和分析，多用图形化的方 式对数据进行显示。
FCM的检测分析
FCM的临床应用
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前 言



流式细胞术（flow cytometry，FCM）是以流式细 胞仪作为检测工具，通过检测标记的荧光信号，在 功能水平上对悬液中的单细胞或其他生物粒子进行 高速、逐一的细胞定量分析和分选技术。 FCM检测对象：细胞及其参数(如DNA含量、细胞体 积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原 等 )。 FCM优点：具有速度快、精度高、准确性好等。
• 以某一类细胞群为检测对象，因此为了减少检测 时的干扰因素，常常在测定前把某一细胞群（单 核细胞或血小板）从血液分离出来，制成单细胞 悬液再进行标记染色。 • 制备单个核细胞悬液的最常用方法是单次密度梯 度离心法
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（二）培养细胞的单细胞悬液制备
悬浮 生长 贴壁 生长
反复吹打
分散 细胞 细胞 脱落
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光学系统
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3.数据处理系统 • 是进行实验数据的分析、存储、显示的重要组件， 由计算机及相应的软件组成。 • 作用 ：将产生的各种光信号成比例的转换成电信 号，进行数字化处理后转入电子计算机进行数据 采集和分析。
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流式细胞仪的数据参数
前向散射光
侧向散射光
荧光
• 三维坐标均为参数（ 散射光或荧光）而非 细胞数 • 对复杂的细胞亚群观 察更为直观、准确， 但对其数据的统计分 析较难
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四、多参数组合分析
• FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术 能够无法显示四维空间结构。 • 随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧 光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以 获得所需的信息。 • 多参数分析能够同时比较各种细胞的不同抗原表 达水平，可以统计出多种数据。
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电荷式分选基本原理
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（二）FCM分选指标 • 细胞分选对仪器的性能要求较高 • 分选是流式细胞仪的重要功能之一 • 分选功能的装置较为复杂
►
分选指标
分选速度 分选收获率
分选纯度
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488 nm 激光
流 式 细 胞 仪 分 选 系 统
前向散射光 检测器
荧光检测器
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流 动 室 和 液 流 驱 动 系 统
•作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。
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FCM的液流系统
（如何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
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2.光学系统 • 由激光光源、分色反光镜、光速成形器、透镜组 和光电倍增管组成。 • 流式细胞仪的测定是基于对光信号的检测来实现 的，因此光学系统是流式细胞仪中最为重要的一 个系统。
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第一节 FCM的检测原理
激光
光电 倍增管
放大电路
激光技术 单克隆抗体技术 细胞荧光化学技术 光电测量技术 电子物理技术 电子计算机技术 能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选 人民卫生出版社
一、细胞分析原理
荧光显微镜技术 激发光源改为激光
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（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
• 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。 • 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和 甲氧-双氧水处理法。 • 石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底， 获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过 长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可 获得单细胞悬液。
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四、流式细胞术定量分析的注意事项
（一）影响因素
温度
pH值
固定剂
非特异 荧光
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（二）质量控制
环境 要求 仪器 校正 样本 要求
设置 对照
数据的获 取和分析
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（三）注意事项
• • • • • • 确保标本上机检测前的浓度为1×106/ml，细胞浓度过 低可直接影响检测结果。 封闭非特异性结合位点，尤其在间接免疫荧光标记时必 不可少。 荧光抗体染色后需充分洗涤，注意混匀、低速离心，减 少重叠细胞和细胞碎片。 注意避光染色，保证细胞免疫荧光的稳定。 设置对照样品，应采用与抗体来源同型匹配的无关对照 和荧光抗体的本底对照。 判定结果时，应注意减去本底荧光，使免疫荧光的定量 分析更准确。 人民卫生出版社
常规 洗涤 低速 离心
低速 离心 漂洗 重悬
单细胞 悬液
蛋白酶消化 机械吹打
培养细胞一般是以悬浮或贴壁的方式生长
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（三）新鲜实体组织单细胞悬液制备
• 将新鲜实体组织进行单细胞悬液的制备是一项困 难而复杂的技术。理想的状态是既要达到分离细 胞的目的又要不损伤细胞。 • 最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
电磁场
-
+
单个细胞被分类 进入检测管
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三、流式细胞术的特点
速度快 灵敏度高 多参数 精度高 纯度高 无害性
对单个细胞或生物颗粒进行快速、逐个检测， 测量速度可以达到每秒数千个甚至上万个细胞
每个细胞上只需带有1000～3000个荧光分子即能检测 出来
多色荧光染色同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特 征 在细胞悬液中检测细胞，比其他技术的变异系数更小， 分辨率更高 可以把指定特征的细胞分选出来，分选细胞的纯度可 达到99%以上 能保持细胞不被破坏，进行无害性定性或定量分析和分 选
第二节 FCM的关键技术
一、FCM单细胞标本的制备
流式细胞术的测定样本必须保证是单细胞悬液，这 是进行流式细胞分析的最关键的第一步。
单细胞悬液大多来自生物样品，主要来源于培养细 胞、血液、新鲜实体组织及石蜡包埋组织等，不同 来源的样本制备单细胞悬液的方法也不同。
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（一）外周血单细胞悬液制备
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前向散射光检测器 在激光束的正前方， 又称小角散射 FSC信号的强弱与 细胞的体积大小成 正比，检测的是细 胞或其他颗粒的表 面属性
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射 SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
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前向散射光示意图
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二、双参数直方图
• 双参数直方图是一种细胞与双测量参数的图形， X 轴与Y轴分别代表一种参数。 • 双参数信号常采用对数信号，最常用的基本表示 法是用点密图来显示。 • 如果把一个散点图分别投影到X轴和Y轴，可得到 两个单参数直方图。 • 临床实践中常以多个散点图联合分析。
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单克隆抗体与 荧光染料技术
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
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计算机技术 处理光信号
（一）流式细胞仪基本结构
1.液流系统
包括流动室和液流驱动系统 • 流动室 由样品管、鞘液和喷嘴等组成，是流式细胞仪的 核心组件，在这里待测样品与激光相交。 • 液流驱动系统 包括压缩空气泵、压力感受器、鞘液过滤器和样 品压力调节器等。
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Region设置
1
• 指同一张单参数或双参数直方图中根据信号的强 弱来划定分析区域，从而计算分析区域内的细胞 数量。
Gate设置
2
• 指在某一张选定参数的直方图上根据该图的细胞 群分布选定要分析的特定细胞群，并要求该样本 的所有其他参数组合的直方图只体现该群细胞的 分布情况。
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•
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（二）细胞分析原理
单 细 胞 悬 液
特异性荧光染料 标记抗体染色
恒定气压
流动 室
细胞单行排列
检 测 区
高度聚焦 激光束
鞘液喷出
特异性荧光 +
散射光
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细胞分析原理
入射光束 与液柱 垂直方向 前向小角方向 光信号
荧光信号 侧向散射光信号 前向散射光信号
荧光检测系统
散射光检测系统
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2.间接免疫荧光染色法
二抗
优 点
① 敏感性高 ② 具有更广的通用性 ①操作步骤繁琐， 干扰因素较多 ②易产生非特异性染色， 结果判断有时比较困难
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缺 点
一抗
3.多参数分析时荧光抗体的组合标记 • 多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的合 成及抗体标记物的发展。 • 多色标记简便、省时、节约成本，但对操作人员 的要求较高。 • 试剂的选择还需结合仪器的配置考虑。
488
488 488 488 488 488
免疫荧光
免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 DNA染色
PI APC
620 670
橙红色 红色
633
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（二）FCM荧光染色的主要方法
1.直接免疫荧光染色法
优 点
① 操作简单，方法简便、快速 ② 特异性强，与其他抗原交叉染色较少 ③ 反应中只有两种因素（细胞与抗体） 参与，结果判断较简单
第十八章
流式细胞术
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本章要点 1. 流式细胞术（FCM）的基本含义。 2. 流式细胞仪的基本结构及检测原理。 3. FCM单细胞标本的制备及荧光染色的主 要方法。 4. FCM的检测分析方法。 5. 流式免疫荧光技术的应用。
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目
1 2 3 4
录
FCM的检测原理 FCM的关键技术
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（一）FCM常见荧光染料的种类和特性
理想的荧光染料需要具备：
应有较高的量子产额和消光系数
对488nm波长的激发光有较强的吸 收能力 发射光与激发光之间应有较大波长 差 容易与被标记的单克隆抗体结合而 不影响抗体自身的特异性。 人民卫生出版社
常用荧光染料的特性和应用
荧光染料 FITC PE（RDI） PE-Cy5 PE-Cy7 ECD 激发光 (nm) 发射 光 (nm) 525 575 670 755 620 颜色 绿色 橙色 红色 深红色 橙红色 应用
前向散射光感受器 计算机系统
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转换
电信号
放大
不同光信号的转换
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二、细胞分选原理
（一）分选的基本原理
• 流式细胞仪的分选是指从细胞群体中分离出感兴 趣的细胞，检测的任意参数都可作为分选时指定 的细胞的依据。 • 分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
点图
X轴反映SSC的信号强弱 Y轴反映FSC的信号强弱
X轴反映FITC荧光信号强弱 Y轴反映PE荧光信号强弱 人民卫生出版社
二维等高图 • 把代表相同细胞数目的 点依次连接起来形成密 闭曲线，越在里面的曲 线代表的细胞数目越多， 越密集的区域也就是细 胞数目变化最快的区间。
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三、三参数直方图
结构复杂程度
细胞大小 侧向散射光示意图
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血 液 白 细 胞 散 点 图
粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
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•
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料 受激光激发后产生。 特异性荧光探针与单克隆抗体结合后，与细胞膜 或细胞内的靶抗原结合，经染色后的细胞在激光 的照射下，荧光染料发出比激发光波长长的荧光， 检测荧光素信号的强弱就可以了解抗原表达量的 多少。
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二、FCM样品的荧光染色
• FCM主要的信号参数包括散射光信号和荧光信号， 荧光染色是保证荧光信号产生的关键步骤。 • 目前间接免疫荧光染色已较少用；直接免疫荧光 染色以双色以上分析较为常用。 • 单色免疫荧光多用于单克隆抗体特异性较高、单 一细胞群的抗原检测，多色免疫表型分析宜采用 同一品牌的试剂。
Region设置
Gate设置
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第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
• 淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群， 是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞， 主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。 • 不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性， 在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的 CD抗原进 行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫 相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
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一、单参数直方图
• X轴代表一维参数。以通道表示，其 与光强度之间的关系依放大器的性质 而定，通道右侧信号的光强度明显高 于左侧，越靠右侧光亮度越强。
• Y轴代表颗粒计数，反映相同荧光或 散射光强度的颗粒相对数量的多少， 可用于定性、定量资料的分析。
单参数分析只能表达具有相同特性细胞数量 与光信号强度的关系。