野生型和突变型GDF5蛋白表达及亚细胞定位
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【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ５； ｇｅｎｅ ｍｕｔａｎｔ； ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ
生 长 分 化 因 子 ５（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ５，
ＧＤＦ５） 又 称 软 骨 形 态 发 生 蛋 白 －１（ ｃａｒｔｉｌａｇｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ
变可以引起多种类型的骨骼发育不良疾病。在前期 工 作 中 ， ＧＤＦ５－Ｌ３７３Ｒ为 本 课 题 组 首 次 发 现 的 与 ＳＹＭ１（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｓｙｍｐｈａｌａｎｇｉｓｍ １）相关的ＧＤＦ５在前 结构域的突变，并且该突变位点位于核定位信号和 前蛋白酶水解位点附近。为了研究Ｌ３７３Ｒ突变后对 ＧＤＦ５蛋白的亚细胞定位是否产生影响，我们构建了 ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－ＷＴ和 ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－ Ｌ３７３Ｒ的真核表达载体，转染ＨＥＫ－２９３细胞，观察突 变后ＧＤＦ５蛋白的表达和定位情况，为进一步研究此 基因突变的致病机制以及其参与的一系列生理病理 过程奠定基础。
【关键词】 生长分化因子５；基因突变；蛋白表达；ＨＥＫ－２９３细胞系 【中图分类号】 Ｑ２５７ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 １００６－２９４７（２０１２）０６－０５３０－０４
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ＧＤＦ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌｓ
ＬＩＵ Ｘｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｓｈｕ－ｓｅｎ，ＬＩＵ Ｑｉ，ＧＡＯ Ｊｉｎ－ｌａｎ，ＬＵＯ Ｙａｎｇ＊
（Ｔｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ＭＯＨ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ， Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００１， Ｃｈｉｎａ）
解剖科学进展 Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２ Ｎｏｖ，１８（６）：５３０￣５３３
野生型和突变型ＧＤＦ５蛋白表达及亚细胞定位的研究
刘 杏，王述森，刘 琦，高锦兰，罗 阳＊
（中国医科大学 医学基因组学教研室 卫生部细胞生物学重点实验室暨教育部医学细胞生物学重点实验室，辽宁 沈阳 １１０００１）
【摘要】 目的 研究人生长分化因子５基因（ＧＤＦ５）ｃ．１１１８Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｌ３７３Ｒ）突变对ＧＤＦ５蛋白在ＨＥＫ－ ２９３细胞系表达及其亚细胞定位的影响。方法 构建ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－ＷＴ和ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－Ｌ３７３Ｒ载体， 分别转染ＨＥＫ－２９３细胞，细胞培养７２ｈ后通过荧光显微镜观察比较野生型和突变型ＧＤＦ５蛋白荧光分布情况。 结 果 ＧＤＦ５蛋白在ＨＥＫ－２９３细胞中成功表达，在荧光显微镜下观察到转染野生型和突变型ＧＤＦ５的细胞胞浆均匀发 出红色荧光，而空载体组的红色荧光则弥散于全细胞，荧光强度均匀一致。结论 野生型和突变型ＧＤＦ５蛋白均 定位于ＨＥＫ－２９３细胞质。
ＧＤＦ５属于分泌蛋白，同时最新研究表明其具有
核定位信号［１］，可能会存在入核现象，进而参与调控
细胞核中某些生物学事件。另一方面，
基因突
【收稿日期】２０１２－０９－１１ 【基金项目】国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０９７１１６４） ＊通讯作者（Ｔｏ ｗｈｏｍ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ａｄｄｒｅｓｓｅｄ）
ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－１， ＣＤＭＰ－１），是骨形态发生蛋
白（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）家族和转化生
长因子β（ｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ，ＴＧＦ－β）超
家族的一员，作为机体软骨形成、骨骼发育的重要调
节因子之一，近年来受到了广泛的研究与关注。
【 Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ５ ｇｅｎｅ（ＧＤＦ５） ｃ．１１１８Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｌ３７３Ｒ） ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－ＷＴ ａｎｄ ｐＤｓＲｅｄ１－ Ｎ１－ＧＤＦ５－Ｌ３７３Ｒ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ， ７２ ｈｏｕｒｓ ｌａｔｅｒ，ｔｈｅ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ＧＤＦ５ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＤＦ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－ＷＴ ａｎｄ ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－Ｌ３７３Ｒ ， ｔｈｅ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ＧＤＦ５ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ １ｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｗｉｔｈ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ， ｗｈｉｌｅ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｕｓ ｏｆ ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｗｉｌｄ－ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ＧＤＦ５ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｏｆ ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌｓ．
生 长 分 化 因 子 ５（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ５，
ＧＤＦ５） 又 称 软 骨 形 态 发 生 蛋 白 －１（ ｃａｒｔｉｌａｇｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ
变可以引起多种类型的骨骼发育不良疾病。在前期 工 作 中 ， ＧＤＦ５－Ｌ３７３Ｒ为 本 课 题 组 首 次 发 现 的 与 ＳＹＭ１（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｓｙｍｐｈａｌａｎｇｉｓｍ １）相关的ＧＤＦ５在前 结构域的突变，并且该突变位点位于核定位信号和 前蛋白酶水解位点附近。为了研究Ｌ３７３Ｒ突变后对 ＧＤＦ５蛋白的亚细胞定位是否产生影响，我们构建了 ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－ＷＴ和 ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－ Ｌ３７３Ｒ的真核表达载体，转染ＨＥＫ－２９３细胞，观察突 变后ＧＤＦ５蛋白的表达和定位情况，为进一步研究此 基因突变的致病机制以及其参与的一系列生理病理 过程奠定基础。
【关键词】 生长分化因子５；基因突变；蛋白表达；ＨＥＫ－２９３细胞系 【中图分类号】 Ｑ２５７ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 １００６－２９４７（２０１２）０６－０５３０－０４
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ＧＤＦ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌｓ
ＬＩＵ Ｘｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｓｈｕ－ｓｅｎ，ＬＩＵ Ｑｉ，ＧＡＯ Ｊｉｎ－ｌａｎ，ＬＵＯ Ｙａｎｇ＊
（Ｔｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ＭＯＨ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ， Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００１， Ｃｈｉｎａ）
解剖科学进展 Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２ Ｎｏｖ，１８（６）：５３０￣５３３
野生型和突变型ＧＤＦ５蛋白表达及亚细胞定位的研究
刘 杏，王述森，刘 琦，高锦兰，罗 阳＊
（中国医科大学 医学基因组学教研室 卫生部细胞生物学重点实验室暨教育部医学细胞生物学重点实验室，辽宁 沈阳 １１０００１）
【摘要】 目的 研究人生长分化因子５基因（ＧＤＦ５）ｃ．１１１８Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｌ３７３Ｒ）突变对ＧＤＦ５蛋白在ＨＥＫ－ ２９３细胞系表达及其亚细胞定位的影响。方法 构建ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－ＷＴ和ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－Ｌ３７３Ｒ载体， 分别转染ＨＥＫ－２９３细胞，细胞培养７２ｈ后通过荧光显微镜观察比较野生型和突变型ＧＤＦ５蛋白荧光分布情况。 结 果 ＧＤＦ５蛋白在ＨＥＫ－２９３细胞中成功表达，在荧光显微镜下观察到转染野生型和突变型ＧＤＦ５的细胞胞浆均匀发 出红色荧光，而空载体组的红色荧光则弥散于全细胞，荧光强度均匀一致。结论 野生型和突变型ＧＤＦ５蛋白均 定位于ＨＥＫ－２９３细胞质。
ＧＤＦ５属于分泌蛋白，同时最新研究表明其具有
核定位信号［１］，可能会存在入核现象，进而参与调控
细胞核中某些生物学事件。另一方面，
基因突
【收稿日期】２０１２－０９－１１ 【基金项目】国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０９７１１６４） ＊通讯作者（Ｔｏ ｗｈｏｍ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ａｄｄｒｅｓｓｅｄ）
ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－１， ＣＤＭＰ－１），是骨形态发生蛋
白（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）家族和转化生
长因子β（ｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ，ＴＧＦ－β）超
家族的一员，作为机体软骨形成、骨骼发育的重要调
节因子之一，近年来受到了广泛的研究与关注。
【 Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ５ ｇｅｎｅ（ＧＤＦ５） ｃ．１１１８Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｌ３７３Ｒ） ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－ＷＴ ａｎｄ ｐＤｓＲｅｄ１－ Ｎ１－ＧＤＦ５－Ｌ３７３Ｒ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ， ７２ ｈｏｕｒｓ ｌａｔｅｒ，ｔｈｅ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ＧＤＦ５ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＤＦ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－ＷＴ ａｎｄ ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１－ＧＤＦ５－Ｌ３７３Ｒ ， ｔｈｅ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ＧＤＦ５ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ １ｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｗｉｔｈ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ， ｗｈｉｌｅ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｕｓ ｏｆ ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐＤｓＲｅｄ１－Ｎ１． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｗｉｌｄ－ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ＧＤＦ５ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｏｆ ＨＥＫ－２９３ ｃｅｌｌｓ．