华中农业大学博士论文答辩

二、gcNODs基因的克隆与表达分析
1.2 gcNOD2:
cDNA全长3130bp，编码982个氨基酸； ORF为2949bp，编码982氨基酸，5′-UTR为 81bp， 3′-UTR为103bp， C端LRR有7个串联 结构域；N端有两个CARD，结构域在27-81 、111-200；中间NACHT结构域在271-441。
6
7
8
31.0 20.1
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
12. gcNOD1蛋白的免疫组化
A B C
D
E
F
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
13.小结 （1）首次从鱼类中克隆了NOD1和NOD2基 因，氨基酸的排列、基因组结构以及内含 子相位的分析都显示了NOD1和NOD2在 进化上具有很强的保守性； （2）荧光定量分析显示草鱼的NOD1和 NOD2基因呈广泛的组成性表达分布，在 所检测的组织中都可以检测到表达；
974 96 81 715 2324 131 99 96 471 895
草鱼NOD1基因组全长9kb,由11个外显子和10个内含子组成
561 127 1765 84 84 84 84 84 84 173
grass carp NOD2
319 266 147 108 87 89 190 90 511
草鱼NOD2基因组全长5kb,由10个外显子和9个内含子组成
*
NOD1 NOD2
* * * * *
*
BL
HK tissues
TK
SP
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
10. gcNODs基因在呼肠孤病毒感染下的诱导型表达
45 40
35
*
Fold changes
30 25 20 15 10 5 0
* * * * * * * * * *
4d Days 5d
*
100 100
100
human CARD12 chimpanzee CARD12
0. 2
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
6. gcNODs基因在不同组织中的组成性表达
12
Fold changes relative to trunk kidney
10
NOD1
8 6
4 2 0 TK L BL HK Br G SP I
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
1. gcNODs基因的分子特点 1.1 gcNOD1:
cDNA包含3215bp，ORF区域为2813bp，大 约编码937个氨基酸, 5′-UTR为350bp， 3′-UTR 为52bp 。 C端的LRR结构域，位置在769-791、 825-851；N端有一个CARD，结构域在11-73； NOD1的NACHT结构域在186-359。
一、研究背景
2.NOD蛋白的组成和结构 通过对人类基因数据库同源搜索，现已发现20多 个成员： NOD1(CARD4)、NOD2(CARD15)、 NOD3-NOD5、 NALP1-14 、IPAF、CIITA、NAIP 等。 NOD 蛋白主要由三个不同的结构域组成： （1）LRR：是富含亮氨酸的重复序列，位于C端 （2）NACHT：位于中央，对于NOD蛋白的寡聚体化 和活化非常重要。 （3）效应结构域：位于N端，可以是1个PYD，1个或 2个CARD ，或者是3个BIR。
博士论文答辩
草鱼核苷酸结合寡聚化结构域 (nucleotidebinding oligomerization domain，NOD )基因和 γ-干扰素相关基因( IFN-gamma related gene， IFN-γrel)的克隆及其表达
指导教师：彭克美 教 授 聂 品 研究员 答 辩 人：陈文钦
一、研究背景
4.NOD 蛋白的信号转导 在非活化状态，NOD1、NOD2 的LRR 和NACHT结合保持分子处于折叠状态。当 NOD1 和NOD2通过LRR 和配体结合后可 以打开，通过NACHT自身寡聚，NOD分子 的CARD 和下游RICK分子的CARD 结构域 发生嗜同种结合，活化RICK。经过复杂的 磷酸化，活化NF- κB，诱导促炎细胞因子 的转录以及抗菌肽的合成。
100 100 77 79 100 100
stickleback NOD1 medaka NOD1 fugu NOD2 stickleback NOD2 medaka NOD2
grass crap NOD2
100 100 100 100 96 100
zebrafish NOD2 mouse NOD2 human NOD2 chimpanzee NOD2 pig NOD2 cattle NOD2 mouse CARD12 monkey CARD12
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
草鱼NOD1
草鱼NOD2
CARD
NACHT
Leucine Rich Repeat
草鱼NODs基因的结构示意图
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
2. gcNODs基因的基因组结构
524
175 1804 84 84 84 84 84 84 84 124
grass carp NOD1
hNOD2
0
1
2
2
2
2
2
2
2
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
4. gcNODs基因与其他物种NODs基因的氨基酸相同/相 似性比较
Full-length zebrafish NOD1 human NOD1 pig NOD1 mouse NOD1 81.3/86.7 50.2/70.9 51.1/71.5 50.4/70.9 Full-length zebrafish NOD2 human NOD2 pig NOD2 mouse NOD2 83.8/92.0 45.6/62.6 46.8/65.2 47.0/64.7 CARDs 73.1/75.6 38.4/54.7 34.9/52.3 39.5/52.3 CARDs 68.5/77.6 29.6/46.5 27.6/47.4 28.5/48.4 NACHT 92.5/95.4 58.0/73.0 58.6/74.7 58.0/76.4 NACHT 90.1/95.9 57.3/73.1 56.7/73.7 59.6/74.3 LRRs 88.2/94.9 57.9/78.5 57.9/76.9 54.9/74.4 LRRs 82.8/91.8 54.1/67.8 52.6/69.3 53.0/67.0
华中农业大学动物科技-动物医学学院 2010年5月30日
答辩内容
五、课程学 习及文章发 表情况 一、研究 背景
汇报 内容
二、草鱼 NOD基因
四、创新点 及下步研究 计划
三、草鱼γ干扰素相关 基因
一、研究背景
1.概述 以往为人们所熟知的PRRs主要是一些 膜结合蛋白如甘露糖受体、To1l样受体、 CD14和清道夫受体等，主要识别胞外环 境的微生物结构成分。最近的研究发现， 胞浆中也存在着识别细菌和病毒成分的 PRRs——核苷酸结合寡聚化结构域(NOD) 蛋白。
*
NOD1 NOD2
*
*
6d
*
1d
2d
3d
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
11. gcNOD1基因重组蛋白的表达与纯化
97.4 66.2 43.0
31.0
20.1 14.4
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
11. gcNOD1基因重组蛋白的表达与纯化
M
97.4 66.2 43.0
1
2
3
4
5
一、研究背景
6.选题的目的与意义 尽管对哺乳动物胞内模式识别受体在参与 对细菌的识别、诱导炎症反应的作用等方面进 行了深入的研究，但国内外对鱼类NOD基因的 研究仅有2篇报道。迄今为止，对鱼类NOD基 因的结构，转录和蛋白表达的特征以及是否具 有类似于哺乳动物的功能还是不清楚的。本论 文拟通过对草鱼NOD1和NOD2基因的克隆以 及表达分析，旨在揭示鱼类NOD基因的结构与 表达特征。同时该研究为进一步研究NODs基 因的功能奠定了基础。
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
3. gcNODs基因的内含子相位
表1.草鱼、斑马鱼以及人NODs基因内含子相位
1 gcNOD1 zfNOD1 hNOD1 gcNOD2 zfNOD2 0 0 0 0 0 2 1 1 1 1 1 3 2 2 2 2 2 4 2 2 2 2 2 5 2 2 2 2 2 6 2 2 2 2 2 7 2 2 2 2 2 8 2 2 2 2 2 9 2 2 2 2 2 10 2 2 2
NOD2
tissues
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
7. gcNODs基因在肽聚糖刺激下的诱导型表达
PGN
25
* *
Fold changes
20 15 10 5 0 BL HK tissues TK
* *
NOD1 NOD2
*
ห้องสมุดไป่ตู้
SP
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
8. gcNODs基因在脂多糖刺激下的诱导型表达
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
（3）来自革兰氏阳性菌的PGN对草鱼 NOD1的表达在大多数组织中没有显著的 作用； （4）在LPS刺激下，gcNOD1的诱导表达特 征与gcNOD2相似； （5）polyI:C和病毒感染也能诱导gcNOD1 和gcNOD2的表达。
三、gc IFN-γrel基因的克隆与表达分析 1. gcIFN-γrel基因的分子特点 IFN-γrel基因的cDNA包含861bp， 其中 5- UTR长39 bp，ORF长504bp编码167个氨 基酸，3- UTR长316bp。 3- UTR富含AT （75.2%），一个潜在的多腺苷酸加尾信号 （AATAAA)位于poly[A]尾上游13bp。
一、研究背景
• • • NALP1 NALP2-14 NOD1
•
• • • •
NOD2
NOD3 NOD4 NOD5 CIITA
•
•
IPAF
NAIP
X
CARD
PYD
NACHT
NAD
LRR
BIR
AD
FIIND
NOD家族的结构示意图
一、研究背景
3.NOD的识别作用 已有研究表明，NOD1和NOD2是细胞内 细菌肽聚糖的感受器，能识别细菌肽聚糖 (PGN) 的降解产物。NOD1 识别的最小结构 是革兰氏阴性细菌的产物内消旋二氨基庚二 酸(meso-diaminopimelic acid , meso-DAP) ； NOD2 识别细菌的最基本结构是PGN 的胞壁 酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）。MDP 几乎存在于所有细菌的PGN 中，因此， NOD2 既是G+细菌也是G-细菌的感受器。
三、gc IFN-γrel基因的克隆与表达分析
AAATTCGCTTGGTTCACAGCACCAAAACACAAACACAAAGAATGGATTCTTGGCTCAACA M D S W L N TGATGCTGCTGTGTGGACTTCTGTTAATAGCATCTCTTCAGACAACCAACGCTTTCAGAT M M L L C G L L L I A S L Q T T N A F R TTCGACGGTCCAAAAGCGAGATGACCCATTTGGAGACAAATATCCACTCTCTGCAAGAAC F R R S K S E M T H L E T N I H S L Q E ATTATgtaagtgatgtctactatcatgaacttcagcagggggtttgaaagcaactcttgt H Y ctgtgttaacaagatgaatcacttcaagtcctactcatatctgtatgttatagtttggtc ttgcggctaatattagcaagaagagacctattgcacaataaatttcacgaaactttgttc ttagattaggagttaagattcaccagagatgcacattcattcataacgtttgctgttttt tgcccgctttctttagAAAACACGTGGCACAGAATGGGTTTCAAAGTCTGTTTTTGTTCC K T R G T E W V S K S V F V P TCATCTGAACCAGCTGAATgtaagtttttactgtgcaaaatgctaaaatattaaaatgca H L N Q L N actgaatgatatatatgcctctatatatgtatcatgctaataatacttgtttctcttagT CCAAGGCTTCCTGCACTTGTCAGGCGCTGTTGCTTGAAAGAATGCTGAACATCTACGAAG S K A S C T C Q A L L L E R M L N I Y E AACTTTTCCAAGACATGAAGTCTGAGCATAAAGAAGGGAGAAAAGATCTAGACCATCTAA E L F Q D M K S E H K E G R K D L D H L TGGATGAGGTGAAAAAGCTGAGGGGAAATTATAAGGAAGAACATAAAGTATGGAAAGAGC M D E V K K L R G N Y K E E H K V W K E TTCAGGAAATGAACTCAGTCAAGgtaaacattaagagaaagtcctgtcttcattgtgaat L Q E M N S V K gtgtacattttgagttattgaattgctgtttatcatatgatatcaggtcaggtgatataa tatatgatatggtactgtatctaatacaaatatttgtcctcactctcacaagGTGAAAAA V K TGGAACAATCCGAGGAGGAGCATTAAATGACTTTCTCATGGTGTTTGATCGGGCCTCTAC N G T I R G G A L N D F L M V F D R A S AGAAAAACACAAAAAGGTTCAATGAGAAGATCCAAAAGTCATGTCTTTCATTTAGTAAAC T E K H K K V Q * TTGCGCTTTGTTATTGTGTTAGCCTATTTATTTATAAATTATATGGAAATAATTATTTAT TTTTAACTTTATAATGTACTCTACTACACCATCCATAACTTATAATCTAACTTATTCTCA TCACAAGTGTGTTTGCATCATTTACAGTGTACAGAAACGATGAACGTTGATTTCTAACTG GATTTGCTTGAAATATTCTGTGAGCTTCACTGGCTAAATGTTTAATTACAATAAATTAAT TTTGCATTAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAA
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
61
human NOD1 pig NOD1 mouse NOD1 chicken NOD1
100
5. gcNODs基因的分子进化树
99 100
100 89
zebra finch NOD1 frog NOD1
100
grass carp NOD1
zebrafish NOD1 fugu NOD1
LPS
1000
Fold changes
*
100 *
* 10 ** *
* *
NOD1
*
* *
NOD2
1 BL HK TK tissues SP
二、gcNODs基因的克隆与表达分析
9. gcNODs基因在Poly I:C刺激下的诱导型表达
poly I:C
20
Fold changes
15 10 5 0
* * * * *
NODs介导的信号传导通路图
一、研究背景
5.NOD蛋白的生物学功能 NOD蛋白主要的生物学功能是加强 机体免疫系统探测微生物感染的能力， 产生IL-1β等促炎因子，调节免疫应答和 炎症反应。近来的研究发现NOD蛋白除 了识别细菌产物外，还可能诱导细胞凋 亡、直接参与细菌感染的控制。现在也 有最新报道，证明NOD蛋白也在抗病毒 免疫中起着重要作用。