草鱼肌肉生长抑制素cDNA克隆及序列分析

［ 金 项 目］ 庆 市 教 委 科 技项 目（ Ｊ９ ２ ５ ； 庆 文理 学 院科 研 项 目（ ２ ０ Ｓ ６ ） 基 重 Ｋ０１１）重 Ｙ ０９Ｋ ８ ．
［ 作者简介］ 孙翰 昌（ ９ ８一）男 ， １７ ， 海南儋州人 ， 讲师， 士， 硕 主要从事水产生物技术研究
５ ０
Ｄ ５ｔ Ｈ ｅ 由本 实验 室保 存 ．
后不 能产 生有 活性 的 ＭＳ Ｎ， 而 出现 “ 肌 ” Ｔ 从 双 表 型特 征 ｊ Ｍ Ｔ ． Ｓ Ｎ是 肌 肉生长 的负调控 因子 ， 可
影 响养殖 动物 的产 肉量 ， 近年 来 已受 到动 物遗 传 育 种研究 者 的重视 ．
迄今 已有很 多脊椎 动物 的 ＭＳ Ｎ基 因或 ｃ — Ｔ Ｄ Ｎ Ａ序 列被 克隆 ， 关 的研 究 报 道 主要 集 中在 哺 相 乳类 、 类 及 鱼类 的 ＭＳ Ｎｌ ． 鸟 Ｔ ８ 鱼类 中 已报 道 了 Ｊ
其 Ａ ６ ／ ２ ０值 在 １ ８— ． ２０Ａ ８ ． ２ ０之 间 ， 明总 Ｒ Ａ 说 Ｎ
以第 一 链 ｅ Ｎ 为 模 板 ， 行 Ｐ Ｒ 扩 增 ． ＤＡ 进 Ｃ Ｐ Ｒ反 应 体 系 （ ５ Ｌ 为 ： ０×Ｐ Ｒ ｂ ｆ ｒ ． Ｃ ２ ） １ Ｃ ｕ ｅ ５ ｆ ２ Ｌ Ｍｇ １（ ５ｍ ｌＬ １ ５Ｉ ，Ｎ Ｐ （ 种 浓度 ， Ｃ２２ ｍｏ ） ． Ｌ ｄ Ｔ 各 ／ ｘ 为 ２ ５ｍ ｏ ． ｍ ＶＬ）１ Ｌ， 物 （ ０ ｍｍ ｌＬ 各 １ 引 １ ｏ ， ） ／
（ Ｔ 为 引物 ， 转 录反 应 体 系 于 ３ ｄ） 逆 ７℃ 温育 １ ， ｈ
７ ０℃ 温育 １ ｉ． ０ｍｎ
２ 结 果 与 分 析
２ １ 总 Ｒ Ａ的提取 和 Ｒ ． Ｎ Ｔ—Ｐ Ｒ扩增 Ｃ
１４ 逆 转 录产 物 的 Ｐ Ｒ扩增 ． Ｃ
草鱼 肌 肉总 Ｒ Ａ经 １ Ｎ ％琼 脂 糖 凝胶 电泳 检 测 ， 示 ３条清 晰 的条带 ， 示有 较 好 的完 整 性． 显 提
Ｌ， ａ ２ Ｌ， ＤＮＡ ｘ ｄ Ｈ ２ １ ８ ＩＬ． Ｅｘ Ｔ ｑ ０． ｃ １ ｔＬ， ｄ Ｏ ６． ｘ
纯度 较高 ． 经反 转 录 后 ， 引 物 ｆ 用 １和 ｓ １扩增 ， 获 得一 条特 异性 扩增条 带 ， 测序 结果 表 明该条 带 代 表 草鱼 ＭＳ Ｎ ｅ Ｎ Ｔ Ｄ Ａ的 ３端序 列 ， 长度 为 ５ ６ｂ ． ４ ｐ 引物 ｆ ２和 ｓ 扩增 出一 条 长 度 为 ６ ７ ｂ ２则 ４ ｐ的 特 异 性 条带 ， 为草 鱼 Ｍ Ｔ Ｄ Ａ的 中间片段 序列 ． ＳＮｃＮ 反 转 录产物 经 引物 ｛ ３和 ｓ 增 后 ， ３扩 同样 获 得一 条 预期 的特 异性 条带 ， 长度 ８ ７ｂ ， １ ｐ 为草鱼 ＭＳ Ｎ Ｔ ｅＮ Ｄ Ａ的 ５端 序列 。
的 ＭＴ Ｓ Ｎ序 列 同源性 基本反 映 了它们 的亲缘 关 系．
［ 关键 词 ］ 鱼 ； 肉生 长抑 制素 ； 隆 ； 列分析 草 肌 克 序 ［ 中图分类号 ］ ９ ７ ４ ［ ￥ １． 文献标 志码 ］ ［ Ａ 文章 编号 ］ ６ ３—８ １ （ ０ １ ０ ０ ５ ０ １７ ０ ２ ２ １ ） １— ０ ０— ５ 肌 肉生长 抑制 素是转 化生 长 因子 一Ｂ（ｒｎ— ｔ ｓ ａ ｆｒ ｉｇｇｏ ｔ ｆ ｔ —ｐ， Ｇ ｏｍ ｎ ｒｗｈ ａ ｏ ｃｒ Ｔ Ｆ—ｐ） 家 族 的一 超 员， 具有 Ｔ Ｆ—Ｂ共 有 的结 构 特 征 ， Ｇ 如存 在 Ｎ端 前 肽 区 、 白酶水解 位 点及 Ｃ端 活性 区 （ 蛋 含有 多 个 保守 的 Ｃ ｓ残基 ） 但 又 与 Ｔ Ｆ一８超 家 族 其 ｙ ， Ｇ 它成员 的 同源 性很 低 ， 又称 为 Ｇ Ｆ一８ ｇ ｗｈ 故 Ｄ （ ｒ ｔ ｏ ｄｆ ｒｎｉ ｉｎｆｃ ｒ ８ ， ｉｅｅｔ ｔ ｔ 一 ） 其功 能是抑 制肌 肉细 ｆ ａｏ ａ ｏ 胞 的增殖 和分 化． 在小 鼠实验模 型 中发 现 ， Ｔ ＭＳ Ｎ
２ ２ 草鱼 ＭＳ Ｎ ｅ Ｎ ． Ｔ Ｄ Ａ的序 列分析
以引物 ｎ、ｌ 增 Ｍ Ｔ Ｄ Ａ的 ３端序 列 ，Ｃ ｓ扩 Ｓ Ｎｃ Ｎ ＰＲ
反应 程 序 为 ：４ ℃ 预 变 性 ３ ｒｎ ９ ℃ ５ ， ９ ｉ；４ ａ ０ｓ
５ ４℃ ４ ‘ ， ２ｏ ｉ ３ ５Ｓ ７ Ｃ １ｍ ｎ， ５个 循 环 ；２℃ 延 伸 ７ １ ｎ 扩 增 ＭＳ Ｎ ｃ Ｎ 的 中 间 片 段 序 列 时 采 ０ｍｉ． Ｔ Ｄ Ａ 用 ｆ ｓ 物 ， 应条 件 为 ：４℃ 预变 性 ３ｒｉ； ２、 ２引 反 ９ ｎ ａ
２ １ 年 ２月 ０１
重 庆 文理 学 院 学 报 （自然 科 学 版 ）
Ｊｕ ａ ｏ Ｃ ｏｇｉｇＵ ｉｅ ｉ ｆ ｒ ｎ ｃ ｎｅ Ｎ ｔｒｌ ｃ ｎ ｅＥ ｉｏ ） ｏｒ ｌ ｆ ｈｎｑｎ ｎｖｒｔ ｏ ｔ ａｄＳｉ ｃｓ（ ａ ａ Ｓｉ ｃ ｄ ｉ ｎ ｓｙ Ａ ｓ ｅ ｕ ｅ ｔｎ
体 购 自大 连 Ｔ Ｋ Ｒ ａ ａ ａ生 物 工 程 有 限 公 司． ｒ ｏ、 Ｔｉ ｌ ｚ
Ｎ Ａ扩增 的 ３对 引物是 根据 鱼类 ＭＳ Ｎ的保 守 序 Ｔ
列 设计 （ １ ， Ｉｖｔ ｇ ｎ公 司合成 ． 表 ） 由 ｎ ｉｏｅ ｒ
表 １ 扩 增 Ｍ Ｔ Ｄ Ａ 的 ３对 引 物 Ｓ ＮｃＮ
的途 径 ． 因此 ， 行 鱼 类 Ｍ Ｔ 的分 子 克 隆具 有 进 ＳＮ
可达正 常 鼠的 ２～３倍 Ｊ 当 小 鼠注 射 Ｍ Ｔ ． Ｓ Ｎ抗 体 后 ， 骼 肌 重 量 和 力 量 亦 明 显 增 加 』 此 外 ， 骨 ．
ＭＴ Ｓ Ｎ基 因突变可能 引起 ＭＳ Ｎ表达异 常或 活性 Ｔ 降低 ， 致骨 骼 肌过 度 生 长 ， 世 界 闻 名 的 ２个 导 如 双肌牛 品种 即 比利 时蓝 牛 （ ｅ ｉ ｌ ） Ｂ ｌ ａ Ｂｕ 和皮 德 ｇｎ ｅ
ｓ ３：Ｃ Ｔｒ ＴＧ ＣＣ ＣＣｒ ＡＧ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ ｒ ＧＣＧ ＡＴ
１３ 总 Ｒ Ａ的提 取 和第 一链 ｃ Ｎ ． Ｎ Ｄ Ａ的 合成 取５ ０～１０ｍｇ背 部 肌 肉按 照 Ｔｉ ｌ 剂 盒 ０ ｒｏ 试 ｚ 说 明书抽 提 总 Ｒ Ａ， 于 一８ Ｎ 置 ０ｃ Ｃ冰箱 保 存 ． 逆转 录反应 按 照 Ｍ —ＭＬ Ｖ第 一 链 ｅ Ｎ Ｄ Ａ合 成 试 剂盒
１ ２ 主 要试剂 ．
Ｄ Ｐ 及 Ｍ— Ｌ ＥＣ Ｍ Ｖ第 一链 ｃ Ｎ Ｄ Ａ合成试剂盒 购
自上海 生 工 生物 工 程公 司． 于 草 鱼 ＭＳ Ｎ ｃ — 用 Ｔ Ｄ
Ｔ ｑＤ Ａ 聚合 酶 、 脂 糖 、 Ｎ Ｐ 核 酸 分 子 ａ Ｎ 琼 ｄＴ 、 量标 准 Ｄ ２ ０ 、 Ｎ 回收 试剂 盒 、ＭＤ１ Ｌ００ Ｄ Ａ ｐ ８一Ｔ载
［ 摘 要 ］ 用 Ｒ Ｐ Ｒ技 术 ， 草鱼肌 肉组 织 中克 隆 出 ＭＳ Ｎ ｃ Ｎ 利 Ｔ— Ｃ 从 Ｔ Ｄ Ａ序 列 ， 长度 为 ｌ７ ４ｂ ， ６ ｐ
编码 区为 １１ ８ｂ ， ２ ｐ 共编码 ３ ５个氨 基 酸． ７ 前体 蛋 白 包括信 号肽序 列 、 Ｎ端前 肽 区 、 白酶 水 解 蛋
说 明书 进行 ， 以适 量 总 Ｒ Ａ 为 模 板 ， Ｏ ｉ Ｎ 以 ｌｏ ｇ
夜． 随机 挑 取 白色 菌 落 ， Ｐ Ｒ法 检测 出阳性 克 用 Ｃ
隆 ， 交 Ｉｖｒｇｎ上 海 公 司 测 序 ． 序 结 果 用 送 ｎｉｏｅ ｔ 测
Ｄ Ａ ｔｒＤ Ａ ａ 件 分 析 ， 与 Ｇ ｎ ａ ｋ中 的 Ｎ ｓ 、 Ｎ ｍ ｎ软 ａ 并 ｅＢｎ 同源 序列 进行 Ｂ Ａ Ｔ比对 ． ＬＳ
上 游 引 物
ｆ ：Ｃ ＡＣＣＩ Ａ ｌ Ｔ ，】 ＧＣＡＣ Ｔ ＧＧ Ｔ ＧＡ Ｔ ｔ ２：ＧＡＡＡＣ ＧＡＡ Ｃ
ｆ ３：ＣＴＧ＇ Ｉ ＴＣＧＧＧＡＧＡＡＴＧＣＧＡＣＴＡＣ
下 游 引 物
ｓ ：Ｔ Ｃ Ｇ ＡＧＡＡＧＡＣ Ｔ ｌ ＡＴ Ｔ ＴＡ ＧＧ ＧＧ
ｓ ２：ＴＧＴｒＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＡＴＣ＇ Ｉ ＴＧＧＴＧ
９ ＝５ ，２℃ ４ ｓ７ 【 ｉ ，５个循 环 ；２ ４ ｃ ０Ｓ５ Ｉ ５ ，２。 ｍ ｎ ３ ＝１ ７
℃延 伸 １ ｎ 引 物 ｆ 、 ０ｍｉ． ３ ｓ 于扩 增 ＭＳ Ｎ ｅ Ｎ ３用 Ｔ Ｄ Ａ
３条特异 性 扩 增 片 段 经测 序 后 拼 接 ， 得 了 获
１ ６ ｐ的 ｃ Ｎ ４ｂ ７ Ｄ Ａ序 列 ． Ｌ Ｓ Ｂ Ａ Ｔ检 索 同 源序 列 显 示 ， 序列与鱼类 等脊椎动 物 ＭＳ Ｎ ｅ Ｎ 该 Ｔ Ｄ Ａ有较 高 的同源性 ， 草鱼 Ｍ Ｔ Ｄ Ａ 序 列 数 据 已 提交 属 ＳＮｃＮ ．
（ ｉｅｈ ｌ ｒｍ ｌｓ 等 十 多种 鱼 的 Ｍ Ｔ Ｐｍ ｐ ａｅ ｐｏ ｅ ） ｓ ａ Ｓ Ｎ基 因 或 ｃＮ Ｄ Ａ序列 ， 尚无有 关草 鱼 ＭＳ Ｎ的 分子 但 Ｔ 克 隆和序 列分 析 的研 究报 道 ． 鱼类 Ｍ Ｔ Ｓ Ｎ的 分子 克 隆可为 进一 步研究 ＭＳ Ｎ在鱼 类肌 肉生长 、 Ｔ 分 化 中的作用 机理 奠定基 础 ， 可 为鱼 类遗 传 育种 还 方 面的应用 研究 创造条 件 ． 用 基 因工程 技 术敲 利 除鱼类 ＭＳ Ｎ基 因 ， 利用免 疫技 术诱 导 鱼体 产 Ｔ 或 生 ＭＳ Ｎ抗体 ， 消除 ＭＳ Ｎ对 鱼 类肌 肉生 长 的 Ｔ 可 Ｔ 抑制 作用 ， 为养殖 鱼类 产 肉量 的 提高 提供 一种 新
较 大的理论 意 义和应用 价值 ． 研究 选择 我 国重 本
要 的养殖 品种 草鱼为研 究对 象 ， 根据 已报 道 的鱼 类 ＭＳ Ｎ序列 ｌ ｊ利 用 Ｒ Ｔ 】 ， ” Ｔ—Ｐ Ｒ技 术 克 隆 出 Ｃ
草鱼 ＭＳ Ｎ ｃ Ｎ Ｔ Ｄ Ａ并进 行序 列分析 ．
蒙特 牛 （ ｉ ｍ ｎｅ ） 是 由于 ＭＳＮ 基 因突 变 Ｐｅ ｏｔｅ 就 ｄ ｓ Ｔ
基 因敲 除后可 促进肌 细胞增 殖 ， 导致 骨骼 肌 重量
斑 马鱼 （ ａ ｉ ｒ ｉ） 金 头鲷 （ ｐ ｒ ａ ｒｔ ） 溪 Ｄ ｎｏ ｅ ｏ 、 ｒ Ｓ ａ￣ ｕａａ 、
红 点 鲑 （ ａ ｅ ｎ ｓｆ ｎ ｎ ｌ ） Ｓ ｌ ｌ ｕ ｏｔ ａｉ 、黑 头 软 口 鲦 ｖｉ ｉ ｓ
［ 稿 日期 ］ ０ ０—１ 收 ２１ ０—１ ９
ຫໍສະໝຸດ Baidu
１ 材 料 与 方 法
１ １ 实验 动物 、 ． 菌株
实验草 鱼 （ ｔ ｏ ｈ ｒｎ ｏｏ ｅ ｕ ） 自重 Ｃｅ ｐ ａｙｇ ｄ ｎ ｉ ｌ ｓ 购 ｎ ｄｌ
庆北 碚 区天 生桥市 场 ， 质 健 康 ， 长 ３ ｍ， 体 体 ０ｃ 平 均体 重 （０ ４ ０ ． 肠 杆 菌 （ ｓ ｅｉ ｉ ｏｉ ６０－５ ）ｇ大 － Ｅｃ ｒｈａｃｌ ｈ ｃ ）
Ｆｂ ｅ ．．２ １ ０ｌ Ｖ０． ０ Ｎｏ １３ ．１
第３ Ｏ卷
第 １期
草 鱼 肌 肉生长抑 制素 ｃ Ｎ Ｄ Ａ克 隆 及 序 列 分 析
孙翰 昌 ， 黄 利 丁诗 华 ，
（． 庆文理学院 １重 ２ ．西 南 大 学 动物 科 技 学 院 生 命 科 学 与技 术 学 院 ，重庆 永川 ４２６ ； ０ １８ 北碚 ４０ １） ０ ７ ６ 水 产 系 ，水产 科 学 重 庆 市 重 点 实验 室 ，重 庆
位 点 ＲＲ Ｉ Ｒ及 ｃ端活性 区（ ９个保 守的 Ｃ ｓ 含 ｙ 残基 ） 多重序 列 比较 表 明 ， ． 草鱼 与 斑 马鱼 、 头 黑 软 口鲦之 间的 ＭＳ Ｎ序 列 同源性 在 ９ ％ 以上 ， Ｔ ４ 与其 它鱼 类之 间 的序 列 同源性 也 较 高 （ ８ １ ７ ． ％
一
８ ． ％ ） 但 与 鸟类 、 乳类之 间的序 列 同源性 则相 对较低 ． ２３ ， 哺 系统进 化 分 析显 示 ， 同物 种 间 不