密度梯度离心法取单个核细胞具体方法
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密度梯度离心法取单个核细胞
密度梯度离心法
• 密度梯度离心法又称为区带离心法，可以 同时使样品中几个或全部组分分离，具有 良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于 一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中， 离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱 中。
密度梯度离心法
密度梯度离心原理
• 不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定 离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降， 在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
10％
混合，测比重为1.077～1.078，G５玻璃滤
器过滤除菌。４℃冰箱保存备用。
实验所需试剂的配置方法
三、磷酸缓冲液(PB)
原液: A液: 0.2M NaH２PO４溶液 NaH２PO４ 或NaH２PO４·2H２O 蒸馏水 溶解至 B液：0.2M Ha２HPO４溶液 Ha２HPO４·12H２O 蒸馏水溶解至1000毫升 各种不同PH值PB的配法
实验补充知识
• 本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴 细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80 ％以上，其高低与室温有关，超过25℃时 会影响细胞获得率。
Na２HPO４·12H２O ： 0.12 克
KH２HPO４：0.06克
葡萄糖
1.0克
双蒸水
1000毫克
1％酚红液
2毫克
将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅
15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
实验所需试剂的配置方法
二、细胞分层液配制法
9％聚蔗糖
24份
34％泛影葡胺
A液
28ml
B液
72ml
加蒸馏水 100ml
实验所需试剂的配置方法
四、血球保存液
葡萄糖 2.05克 枸椽酸钠 0.8克 氯化钠 0.42克 蒸馏水 100毫升
将上述成分混匀，略加温使其溶解，分 装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭 菌。4℃保存备用。
实验所需试剂的配置方法
五、RPMI-1640培养液
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞（PBMC）的实验方法
一、步骤 1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混
匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚 的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液， 下层主 要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中 层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单 个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
活细胞百分率＝
活细胞数 总细胞数
×100％
用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达 80～90％，活细胞百分率在95％以上。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
二、试剂和材料 比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞
分离液)。 Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋) 10％小牛血清RPMI1640 0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。 肝素用Hank‘s液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝
蔗糖密度梯度离心法
• 采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心 机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上 一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成 层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分， 就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码， 取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与密 度梯度离心法不同的一种沉降速度法，除了以相 同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出 分离物这点上是有优越性的。因多采用蔗糖密度 梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。按同样 原理，也可使用分析超离心机进行测定。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单
个核细胞(PBMC)的实验方法
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。 置入另一短中管中，加入５倍以上体积的 Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟， 洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛 血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞 悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球 计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数
4
×104×2 （稀释倍数）
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞 不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百 分率。
实验补充知识
• 分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳， 因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个 核细胞在1.076～1.090之间。而不同动物血中的单个核细 胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为1.088，马为 1.090。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全 血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液 上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心 管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细 胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串 钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中， 唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层 液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。
95毫
1毫
1毫升 1毫升 1毫升 1毫升
实验所需试剂的配置方法
七、完全RPMI-1640培养液 不完全1640培养液 灭活胎牛(或新生牛)血清
90毫升 10毫升
实验补充知识
• 聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液， 其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖 （商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密 度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶 液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低 浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛 影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品 Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分 层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即 可配制成密度合适分层液。
• 介质梯度应预先形成，介质的最大密度要 小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、 甘油；
• 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由 管口到管底逐步升高的密度梯度。
密度梯度离心可用来分离核酸、蛋 白质、核糖体亚基及其它成分。
密度梯度离心法
• 也称“平衡密度梯度离心法”：用超离心机对小 分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降 平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度 梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶 液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比 溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力 平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种 现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据 其差别进行分析的一种沉降平衡法。
胞数。 • 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的
增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
• 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相 应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
实验所需试剂的配置方法
一、Hank‘s液(无Ca２＋、Mg２＋)配制法
NaCl ： 8.0 克
KCl ： 0.4 克
27.6克 31.2克 1000毫升
71.6克
实验所需试剂的配置方法
PH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
A液 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5 （ml） B液 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5 （ml）
举例：0.1M PH7.2 PB
RPMT-1640(FLOW公司出品) 1袋
三蒸水
1000毫升
电磁搅拌30分钟：1N HCl调PH7.2～
7.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验，
4℃保存。
实验所需试剂的配置方法
六、不完全RPMI-1640培养液
RPMI-1640
0.1M丙酮酸钠
0.2M谷氨酰胺 1M Hepes 7.5％ NaHCO３ 青霉素、链霉素(各1万单位)
分离活细胞的介质要求
• 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不 高；
• 2）PH中性或易调为中性； • 3）浓度大时渗透压不大； • 4）对细胞无毒。
密度梯度离心法应用
• 利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或 precoll液分离和纯化人或动物外周血单个核 细胞（PBMC）。
• 目前比较常用ficoll密度梯度法。
人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。 短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。 无菌干燥注射器针头。 血球计数板、显微镜、水平式离心机。 碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
三、注意事项 • 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。 • 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细
密度梯度离心法
• 密度梯度离心法又称为区带离心法，可以 同时使样品中几个或全部组分分离，具有 良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于 一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中， 离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱 中。
密度梯度离心法
密度梯度离心原理
• 不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定 离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降， 在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
10％
混合，测比重为1.077～1.078，G５玻璃滤
器过滤除菌。４℃冰箱保存备用。
实验所需试剂的配置方法
三、磷酸缓冲液(PB)
原液: A液: 0.2M NaH２PO４溶液 NaH２PO４ 或NaH２PO４·2H２O 蒸馏水 溶解至 B液：0.2M Ha２HPO４溶液 Ha２HPO４·12H２O 蒸馏水溶解至1000毫升 各种不同PH值PB的配法
实验补充知识
• 本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴 细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80 ％以上，其高低与室温有关，超过25℃时 会影响细胞获得率。
Na２HPO４·12H２O ： 0.12 克
KH２HPO４：0.06克
葡萄糖
1.0克
双蒸水
1000毫克
1％酚红液
2毫克
将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅
15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
实验所需试剂的配置方法
二、细胞分层液配制法
9％聚蔗糖
24份
34％泛影葡胺
A液
28ml
B液
72ml
加蒸馏水 100ml
实验所需试剂的配置方法
四、血球保存液
葡萄糖 2.05克 枸椽酸钠 0.8克 氯化钠 0.42克 蒸馏水 100毫升
将上述成分混匀，略加温使其溶解，分 装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭 菌。4℃保存备用。
实验所需试剂的配置方法
五、RPMI-1640培养液
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞（PBMC）的实验方法
一、步骤 1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混
匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚 的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液， 下层主 要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中 层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单 个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
活细胞百分率＝
活细胞数 总细胞数
×100％
用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达 80～90％，活细胞百分率在95％以上。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
二、试剂和材料 比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞
分离液)。 Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋) 10％小牛血清RPMI1640 0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。 肝素用Hank‘s液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝
蔗糖密度梯度离心法
• 采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心 机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上 一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成 层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分， 就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码， 取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与密 度梯度离心法不同的一种沉降速度法，除了以相 同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出 分离物这点上是有优越性的。因多采用蔗糖密度 梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。按同样 原理，也可使用分析超离心机进行测定。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单
个核细胞(PBMC)的实验方法
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。 置入另一短中管中，加入５倍以上体积的 Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟， 洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛 血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞 悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球 计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数
4
×104×2 （稀释倍数）
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞 不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百 分率。
实验补充知识
• 分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳， 因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个 核细胞在1.076～1.090之间。而不同动物血中的单个核细 胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为1.088，马为 1.090。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全 血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液 上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心 管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细 胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串 钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中， 唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层 液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。
95毫
1毫
1毫升 1毫升 1毫升 1毫升
实验所需试剂的配置方法
七、完全RPMI-1640培养液 不完全1640培养液 灭活胎牛(或新生牛)血清
90毫升 10毫升
实验补充知识
• 聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液， 其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖 （商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密 度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶 液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低 浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛 影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品 Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分 层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即 可配制成密度合适分层液。
• 介质梯度应预先形成，介质的最大密度要 小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、 甘油；
• 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由 管口到管底逐步升高的密度梯度。
密度梯度离心可用来分离核酸、蛋 白质、核糖体亚基及其它成分。
密度梯度离心法
• 也称“平衡密度梯度离心法”：用超离心机对小 分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降 平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度 梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶 液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比 溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力 平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种 现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据 其差别进行分析的一种沉降平衡法。
胞数。 • 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的
增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
• 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相 应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
实验所需试剂的配置方法
一、Hank‘s液(无Ca２＋、Mg２＋)配制法
NaCl ： 8.0 克
KCl ： 0.4 克
27.6克 31.2克 1000毫升
71.6克
实验所需试剂的配置方法
PH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
A液 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5 （ml） B液 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5 （ml）
举例：0.1M PH7.2 PB
RPMT-1640(FLOW公司出品) 1袋
三蒸水
1000毫升
电磁搅拌30分钟：1N HCl调PH7.2～
7.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验，
4℃保存。
实验所需试剂的配置方法
六、不完全RPMI-1640培养液
RPMI-1640
0.1M丙酮酸钠
0.2M谷氨酰胺 1M Hepes 7.5％ NaHCO３ 青霉素、链霉素(各1万单位)
分离活细胞的介质要求
• 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不 高；
• 2）PH中性或易调为中性； • 3）浓度大时渗透压不大； • 4）对细胞无毒。
密度梯度离心法应用
• 利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或 precoll液分离和纯化人或动物外周血单个核 细胞（PBMC）。
• 目前比较常用ficoll密度梯度法。
人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。 短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。 无菌干燥注射器针头。 血球计数板、显微镜、水平式离心机。 碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞(PBMC)的实验方法
三、注意事项 • 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。 • 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细