菠萝蛋白酶提取

菠萝蛋白酶提取

一．实验目的:

1.了解菠萝蛋白酶的基本性质，设计提取方法并测性其蛋白总量及酶活性；

2.计算从菠萝中提取菠萝蛋白酶时每步的回收率，判断提取方法的优劣。

二．实验原理：

菠萝蛋白酶外观为白色至浅棕黄色无定形粉末；可溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚；属糖蛋白。主要作用原理是使多肽类水解为低分子量的肽类，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。其作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化,啤酒澄清,还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。

提取菠萝蛋白酶的传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。有些研究用超滤法对传统工艺进行了改革,不仅使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。本实验采用新型吸附法提取菠萝蛋白酶,步骤简单,产率比传统方法有所提高,是一种有发展的方法。在新型吸附沉淀法提取菠萝蛋白酶中,所使用的锌离子对酶有激活作用,乙二胺四乙酸是一种螯合物,可有效地螯合原料中某些重金属离子,以避免其与酶结合而使酶失去活性,抗坏血酸则具有还原性,分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态,从而有效地保持酶活性,其中以EDTA 和L2半胱氨酸组合,效果最佳。单宁用量多少会直接影响酶产量,一般范围0. 15 %～0. 25 %的浓度。

采用Folin-酚法测定蛋白酶含量，发生双缩脲反应的蛋白中酚基（酪氨酸），在碱性条件下将磷钼酸和磷钨酸还原成钼酸和钨酸，呈蓝色，在650nm和66onm处有最大吸收值。Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O）组成。多肽中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸、磷钨酸、硫酸和溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被多肽中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与多肽含量成正比。

活性测定方法是以酪蛋白水解释放的氨基酸在275nm的吸收值为基础。酶活单位定义为在37℃，pH7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白所产生的酪氨酸的微克数为一个菠萝蛋白酶单位。pH 值对酶活力有很大的影响,大多数的酶在酸性条件下活力最强,最适合菠萝蛋白酶的pH 为7. 4 ,在碱性条件下就会失活,在操作过程中应注意pH 值的变化。从温度2酶活力曲线上可以看出,温度也是影响酶活力的重要因素之一,最适合的温度为45 ℃。

三．实验步骤：

（1）新型吸附法提取菠萝蛋白酶的过程：

菠萝压榨得汁液, 按压出汁液的体积量加10 %氯化钠,在室温下自然沉降120 h ,弃去沉淀物,得澄清液。将澄清液移入烧杯中,在搅拌条件下,按澄清液体积加入0. 05 %EDTA22Na 、0. 02 %维生素C ,立刻加入0. 1 %的单宁和自制的吸附剂,在4 ℃下静置1 h ,离心弃去上清液,收集沉淀物,加入2～3 倍pH 值为4. 5 的抗坏血酸溶液,静止30 min。离心14 min ,弃去沉淀物,收集滤液,用冷冻真空干燥即得菠萝酶。

（2）蛋白质含量的测定过程：

取12 支试管,分别加入0 ,0. 20 ,0. 40 ,0. 60 ,0. 80 ,1. 00 mL 标准牛血清溶液(500μg/ L ,用水补足1. 00mL ,以上每种浓度各做一份重复,即平行做两份,按顺序向各管加入5 mL Folin-酚试剂甲,混匀。室温下放置10 min 后,再依次向各管加入0. 5 mL Folin-酚试剂乙,

立即摇匀,在30 ℃保温(或室温下放置) 30 min。然后,在721 型分光光度计上进行比色测定。以光密度(O.D. )为纵坐标,以牛血清溶液浓度为横坐标,绘制出牛血清的标准曲线。未知的菠萝蛋白酶的蛋白质含量在曲线中得到。

（3）菠萝蛋白酶活力测得的实验过程：

分别取酶制品0. 15 g 克加入pH7. 0 , 0. 05mol/ L 磷酸缓冲溶液定容至100 mL ,过滤,此滤液为溶液酶制剂。取1 mL 溶液酶加入0. 9 mL 激活剂(pH7. 0 , 0. 05 mol/ L 磷酸缓冲溶液, 内含15mmol/ L 硫代硫酸钠及6 mmol/ L EDTA22Na) ,于37 ℃水浴中保温恒定后,加入同样预热的1 %酪蛋白溶液,混匀,在37 ℃下准确反应10 min ,加入8mL 1N 氢氧化钠溶液,迅速摇匀,于室温放置半小时。取上清液于275 nm 波长下测定OD 值。计算溶液酶的活力。