美白祛斑类化妆品中氨甲环酸的检测方法研究_

美白祛斑类化妆品中氨甲环酸的检测方法研究

随着生活水平和审美标准的提高，白皙与洁润的肌肤成为广大女性的追求目标。黄褐

斑是一种主要在面部等暴露部位存在色素沉积的皮肤病，其病因及发病机理复杂，遗传因素、紫外线照射和激素影响被普遍认为是主要致病因素。氨甲环酸是合成的氨基酸类抗纤

溶药，其主要作用机制是通过抑制蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原的激活，达到止血效果，除

此之外研究发现，其可抑制由紫外线照射导致的色素沉积，达到美白祛斑的疗效。目前市

面上存在很多美白祛斑类化妆品将含氨甲环酸的成分直接加入化妆品中，但由于是法定

适应症之外的用法，无法保证用药安全，一旦产生法律纠纷，处理会很复杂。氨甲环酸是临床上常用的止血药，滥用可能引起视力模糊、头痛、头晕、疲乏等中枢神经系统症状；过量

可致颅内血栓形成和出血，引起继发性肾盂炎症和输尿管凝血块阻塞，此外还有腹泻、恶

心及呕吐等症状。目前，国家食品药品监督管理总局暂未对美白祛斑类化妆品使用氨甲

环酸的问题作出具体规定，但仍有必要对其加强监管，制订相应的检测方法和限量指标。本

实验根据保健食品中非法添加氨甲环酸的检验方法，优化化妆品中前处理和色谱条件，

建立了以 HPLC 分离定量检测美白祛斑类化妆品中的氨甲环酸，采用液质联用法进行结果

确证的检测方法。

仪器与试药

仪器

电子分析天平、离心机、多功能仪表、振荡器、高效液相色谱仪、三重四级杆液质联用仪超高效液相色谱仪。

试药

甲醇、甲酸、十二烷基硫酸钠、磷酸二氢钠、三乙胺、磷酸、吐温 80、氨甲环酸标准品。

方法与结果

HPLC 色谱条件

采用 DIKMASilversil®-C18柱（4.6mm×250mm×5μm），流动相为质量分数 0.23% 十二烷

基硫酸钠（取磷酸二氢钠18.3g，加水800mL溶解，加三乙胺8.3mL混匀后，再加十二烷基

硫酸钠2.3g振摇使溶解，用磷酸调节至pH2.5，加水至1000mL）甲醇（体积比 60/40），流速为1.0mL/min，进样量为10μL，检测波长220 nm，同时用二极管阵列检测器（DAD）监测，柱温30℃。

2.2 LC-MS确证条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇质量分数0.1%甲酸（体积比80/20）为流动相，柱温35℃，流速0.3mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；毛细管电压3.0kV；离子源温度120℃；脱溶剂气温度450℃；脱溶剂气流速 600 L/h；正离子检测；采集方式采用MRM 模式；质量采集范围m/z 50 ~ 600。

溶液制备

对照品溶液的制备

精密称取氨甲环酸对照品26.825 mg，置于25 mL 容量瓶中，加流动相适量溶解并定容，摇匀，即得氨甲环酸对照品储备溶液。

样品溶液的制备

y =2.0494x －0.0208 R 2=0.9994

精密称取样品约 0.5 g ，置于 15 mL 离心管中， 加入 1 mL 吐温 - 80 助溶，加流动相到 10 mL ，振荡器振荡提取 20 min ，再加流动相定容到 15 mL ， 摇匀，用滤纸滤过，取续滤液经 0.45 μm 滤膜滤过。 专属性试验

取空白样品、阳性样品及空白加标样品（取空白样品 0.5 g ，置于 15 mL 离心管中，精密加入氨甲环酸对照品 5 mL ，即得），分别按“2.3.2”项下方法进行样品处理后，按“2.1”项下色谱条件测定，结果发现氨甲环酸与空白基质中干扰成分分离良好， 表明方法专属性符合要求。 线性关系

精密量取氨甲环酸对照储备溶液 1、2、5 和

7 mL 定容至 10 mL 容量瓶，配制成 0、0.1073、

0.2146、0.5365、0.7511 和 1.073 mg/mL 的对照品溶液。进样量为 10 μL 注入高效液相色谱仪，记录色谱图，相应峰面积响应值为 0、0.199、0.407、1.073、1.4905 和 2.203 AU ，以氨甲环酸质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归计算， 求得线性回归方程为 y = 2.0494x － 0.0208，R 2 = 0.9994，具体见图 1。

质量浓度 /（mg · mL －1） 图 1 氨甲环酸线性回归方程

回收率试验

精密称取空白样品约 0.5 g ，置于 15 mL 离心管中，精密加入氨甲环酸对照品 2.25 mg 、7.5 mg 、

12 mg 各三份，加流动相 10 mL ，振荡器提取

20 min ，再加流动相定容到 15 mL ，分别得高、中、低三种加样水平各三个样品。结果高、中、低三个浓度回收率分别为 103.23%（RSD 为 2.49%， n =3），105.15%（RSD 为 1.50%，n =3），104.29% （RSD 为 0.87%，n =3），平均回收率为 104.36% （RSD 为 1.95%，n =9），具体见表 1。 表 1 高中低剂量水平加样回收率结果

加样水平 峰面积 /AU 质量浓度 /（mg · mL －1）

回收率 /%

峰面积响应值 /A U

低 10.29680.1550103.31

低 20.30160.1573104.88

低 30.30100.1570104.68

中 1 1.04700.5210104.21

中 2 1.04800.5215104.30

中 3 1.07500.5347106.94

高 1 1.71700.8480105.99

高 2 1.66300.8216102.70

高 3 1.63500.8079100.99

精密度及溶液稳定性试验

取含氨甲环酸的阳性样品按上述方法在同一

天内平行测定 6 份，RSD 为 1.77%，n=6，取空白样品加标 8 mg，定容到 15 mL，分别在室温下放置 0、1、2、4、8、12 和 24 h 后测定，氨甲环酸峰面积RSD 为 2.5%，n=6，表明氨甲环酸样品溶液在室温放置 24 h 后峰面积无明显变化，基本稳定。

检出限、定量限

取氨甲环酸对照品 10.73 mg 加入空白样品中，按“2.3.2”项下方法制备溶液后，从中取 1 mL 到10 mL 容量瓶，用流动相稀释到刻度。按“2.1”项下色谱条件测定，以 S/N 约为 3 作为检测限，S/N 约为 10 为定量限，当取样量为 0.5 g 时，检出限为

1.45 mg/g，定量限为 4.84 mg/g。

样品测定

按上述方法，对市场上 100 批美白祛斑类化妆

品进行检测，结果有 7 批样品在氨甲环酸对照品色谱峰保留时间出现了色谱峰，且该色谱峰的 DAD 实时光谱图与氨甲环酸对照品一致，初步怀疑该 7 批样品中含有氨甲环酸，7 批阳性样品与氨甲环酸标准品对比见图 2，7 批阳性样品含量见表 2，氨甲环酸标准品图见图3，选取其中 2 批阳性样品色谱图和 DAD 图见图 4、图 5。

图 2 7 批阳性样品与氨甲环酸标准品叠加图

质谱确证