谷氨酸发酵及工艺流程PPT演示课件
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• 流加试剂:将40%尿素溶液、1%水解糖液、4%水解 糖液分别装入流加瓶中,121℃15min备用
7
•
试剂的制备
• 甲液：称取15g硫酸铜与0.05g亚甲基蓝于1000mL 容量瓶中，加蒸馏水定溶至刻度线处
• 乙液：称取50g酒石酸钾钠，75g氢氧化钠，4g亚 铁氰化钾至1000mL容量瓶中，加蒸馏水定溶至刻 度线
系列1
分析：OD值各组变化差距很大，据 我所知是由于操作失误所致
13
茚三酮检测OD值变化情况表
0.35
0.3
0.25
OD
0.2
0.15
值
0.1
系列1
0.05
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
组别
分析：有个别组测的值很高，可能是操作
问题所致，总体来说，谷氨酸检测的OD值
• 革兰氏染色：结晶紫、碘液，95%乙醇、番红
•
仪器准备
• 仪器设备：摇床、显微镜、751型分光光度计、5L 发酵罐、空压机、革兰氏染液、PH计、离心机、 药物天平
8
二、发酵阶段
• 发酵生产操作:发酵液冷却至40℃左右时，通过蠕 动泵加第一次尿素，添加量为0.8~1。0%。
• 接种将前次实验制备的二级种子8-10%的接种量接 入发酵罐。于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养 35h
偏低，不在0.2~0.8这一合理范围之内，失
去意义
14
本组镜检结果
第二阶段，镜片 有污பைடு நூலகம்，无法观 察
• 发酵过程的控制:①温度控制②pH控制③糖液流加
9
温度控制
• 谷氨酸发夹0~12h为长菌期，最适温度在30~32℃， 发酵12小时后进入产酸期，控制34~36℃。由于发 酵期代谢活跃，发酵罐要注意冷却，防止温度过 高引起发酵迟缓。
pH控制
•发酵过程中产物的积累导致pH下降，而氮源的流 加导致pH的升高，发酵中当pH值进行控制既8h前 pH7.0-7.6；8h后pH7.2-7.3，,20-24h期间pH7.07.1,24-35h期间pH6.5-6.6.尿素流加总量为4%
• 还原糖测定：用菲林快速定糖法。 • 菌体形态观察：革兰氏染色，油镜观察菌形、革兰氏染色结果以及有
无杂菌污染
11
清洗仪器
• 放罐：到放罐标准后，及时放罐。经过发酵约35h 后，后残糖在1%以下且糖耗缓慢或残糖＜0.5%， 菌量增长（OD）值缓慢时，便可放罐，放罐操作 同取样。排放液需灭菌处理才可进入下水道
6
发酵培养基的制备
• 发酵培养基：按下列培养基配方制发酵培养基， 并按70%装液量装于小型发酵罐中，离位灭菌， 121℃实罐灭菌20min，冷却备用。
• 葡萄糖10%，玉米浆0.1-0.15%，Na2HPO4 0.17%， KCL 0.12%，MgSO4 0.04%，用NaOH溶液调pH7.20 于110℃灭菌20min冷却备用。
• 清洗：放罐后，将发酵罐清洗干净，关闭所有电 源
• 粗提：用浓硫酸将发酵液pH调至谷氨酸的等电点 （pH3.15），用等电点法进行谷氨酸的粗提。
12
结果分析
样液OD值
• 样液OD值变化表
0.35 0.3
0.25 0.2
0.15 0.1
0.05 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 组别
糖液流加
•从第10h开始每隔4h补糖一次，每次补入1%的水解
糖液，在发酵26h前补入4%的水解糖液。
10
发酵过程中，需注意完成下列工作
• 注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在适合的范围内，遇 有故障及时排除。
• 每两小时取样一次，每次取样80ml，取样时，用量筒准确取流出的 培养液80ml，对号倒入三角瓶中，封口，来不及测定的样液要立即 放入冰箱保存
5
二级种的培养
• 菌种:一级种 • 培养基的配置：按下列培养基配方配制1000ml二级种子培
养基，并按20%装液量分装于三角瓶中后，于121℃灭菌 30min冷却备用。 • 葡萄糖2.5%、玉米浆2.5-3.5、K2HPO4 0.15%、MgSO4 0.04、尿素0.4%、FeSO4 2ppm、MnSO4 2PPm、pH6.8~7.0 • 二级种子培养：在已灭菌的二级种子培养基中，按0.51.0%接入上述以培养好的一级种子，于32℃±1℃、 250r.p.m条件下培养7-8h，二级种子质量要求：种龄7-8h、 pH6.8~7.2、OD值净增0.5左右 无菌检查：噬菌体无、 残糖消耗1%左右 镜检：生长旺盛，排列整齐，G+
2
谷氨酸发酵及工艺流程
一、发酵前准备 二、发酵阶段 三、清洗仪器 四、实验总结
3
一、发酵前准备
• 一级种的培养 • 二级种的培养 • 发酵培养基的配置 • 试剂的配置 • 仪器设备的准备
4
一级种的培养
• 菌种:谷氨酸产生菌BL-115 • 培养基的配置：按下列培养基配方配1000ml一级
种子培养基。按20%装液量分装后，于121℃灭菌 30min冷却备用。 • 葡萄糖2.5%、尿素0.5%、硫酸镁0.04%、磷酸氢二 钾0.1%、玉米浆2.5-3.5%、磷酸亚铁、硫酸锰各 20ppm、pH7.0 • 一级种子培养：将斜面菌种接入已灭菌冷却的一 级种子培养基中（250ml三角瓶内接入1~2环）于 32℃±1℃、250r.p.m条件下培养12h。 • 一级种子质量要求：种龄12h；pH6.4±0.1；光密 度：净增O.D值0.5以上；无菌检查阴性，噬菌体 检查无。
1
谷氨酸的简介
• 谷氨酸，是一种酸性氨基酸。分 子内含两个羧基，化学名称为α氨基戊二酸。谷氨酸是里索逊 1856年发现的，为无色晶体，有 鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶 液，等电点3.22。大量存在于谷 类蛋白质中，动物脑中含量也较 多。谷氨酸在生物体内的蛋白质 代谢过程中占重要地位，参与动 物、植物和微生物中的许多重要 化学反应。
• 每2小时记录发酵过程温度、pH、OD、通风、转速的测定数值，并 记录操作情况。
• OD值测定方法：均匀取样5ml于编号试管中，用空白发酵液稀释至 一定浓度，在722分光光度计上测定A600，根据菌体浓度与吸光度之 间关系的标准曲线换算出菌体浓度；其余发酵于2000r/min条件下离 心分离10min，上清夜入编号三角瓶，用于测糖
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•
试剂的制备
• 甲液：称取15g硫酸铜与0.05g亚甲基蓝于1000mL 容量瓶中，加蒸馏水定溶至刻度线处
• 乙液：称取50g酒石酸钾钠，75g氢氧化钠，4g亚 铁氰化钾至1000mL容量瓶中，加蒸馏水定溶至刻 度线
系列1
分析：OD值各组变化差距很大，据 我所知是由于操作失误所致
13
茚三酮检测OD值变化情况表
0.35
0.3
0.25
OD
0.2
0.15
值
0.1
系列1
0.05
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
组别
分析：有个别组测的值很高，可能是操作
问题所致，总体来说，谷氨酸检测的OD值
• 革兰氏染色：结晶紫、碘液，95%乙醇、番红
•
仪器准备
• 仪器设备：摇床、显微镜、751型分光光度计、5L 发酵罐、空压机、革兰氏染液、PH计、离心机、 药物天平
8
二、发酵阶段
• 发酵生产操作:发酵液冷却至40℃左右时，通过蠕 动泵加第一次尿素，添加量为0.8~1。0%。
• 接种将前次实验制备的二级种子8-10%的接种量接 入发酵罐。于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养 35h
偏低，不在0.2~0.8这一合理范围之内，失
去意义
14
本组镜检结果
第二阶段，镜片 有污பைடு நூலகம்，无法观 察
• 发酵过程的控制:①温度控制②pH控制③糖液流加
9
温度控制
• 谷氨酸发夹0~12h为长菌期，最适温度在30~32℃， 发酵12小时后进入产酸期，控制34~36℃。由于发 酵期代谢活跃，发酵罐要注意冷却，防止温度过 高引起发酵迟缓。
pH控制
•发酵过程中产物的积累导致pH下降，而氮源的流 加导致pH的升高，发酵中当pH值进行控制既8h前 pH7.0-7.6；8h后pH7.2-7.3，,20-24h期间pH7.07.1,24-35h期间pH6.5-6.6.尿素流加总量为4%
• 还原糖测定：用菲林快速定糖法。 • 菌体形态观察：革兰氏染色，油镜观察菌形、革兰氏染色结果以及有
无杂菌污染
11
清洗仪器
• 放罐：到放罐标准后，及时放罐。经过发酵约35h 后，后残糖在1%以下且糖耗缓慢或残糖＜0.5%， 菌量增长（OD）值缓慢时，便可放罐，放罐操作 同取样。排放液需灭菌处理才可进入下水道
6
发酵培养基的制备
• 发酵培养基：按下列培养基配方制发酵培养基， 并按70%装液量装于小型发酵罐中，离位灭菌， 121℃实罐灭菌20min，冷却备用。
• 葡萄糖10%，玉米浆0.1-0.15%，Na2HPO4 0.17%， KCL 0.12%，MgSO4 0.04%，用NaOH溶液调pH7.20 于110℃灭菌20min冷却备用。
• 清洗：放罐后，将发酵罐清洗干净，关闭所有电 源
• 粗提：用浓硫酸将发酵液pH调至谷氨酸的等电点 （pH3.15），用等电点法进行谷氨酸的粗提。
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结果分析
样液OD值
• 样液OD值变化表
0.35 0.3
0.25 0.2
0.15 0.1
0.05 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 组别
糖液流加
•从第10h开始每隔4h补糖一次，每次补入1%的水解
糖液，在发酵26h前补入4%的水解糖液。
10
发酵过程中，需注意完成下列工作
• 注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在适合的范围内，遇 有故障及时排除。
• 每两小时取样一次，每次取样80ml，取样时，用量筒准确取流出的 培养液80ml，对号倒入三角瓶中，封口，来不及测定的样液要立即 放入冰箱保存
5
二级种的培养
• 菌种:一级种 • 培养基的配置：按下列培养基配方配制1000ml二级种子培
养基，并按20%装液量分装于三角瓶中后，于121℃灭菌 30min冷却备用。 • 葡萄糖2.5%、玉米浆2.5-3.5、K2HPO4 0.15%、MgSO4 0.04、尿素0.4%、FeSO4 2ppm、MnSO4 2PPm、pH6.8~7.0 • 二级种子培养：在已灭菌的二级种子培养基中，按0.51.0%接入上述以培养好的一级种子，于32℃±1℃、 250r.p.m条件下培养7-8h，二级种子质量要求：种龄7-8h、 pH6.8~7.2、OD值净增0.5左右 无菌检查：噬菌体无、 残糖消耗1%左右 镜检：生长旺盛，排列整齐，G+
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谷氨酸发酵及工艺流程
一、发酵前准备 二、发酵阶段 三、清洗仪器 四、实验总结
3
一、发酵前准备
• 一级种的培养 • 二级种的培养 • 发酵培养基的配置 • 试剂的配置 • 仪器设备的准备
4
一级种的培养
• 菌种:谷氨酸产生菌BL-115 • 培养基的配置：按下列培养基配方配1000ml一级
种子培养基。按20%装液量分装后，于121℃灭菌 30min冷却备用。 • 葡萄糖2.5%、尿素0.5%、硫酸镁0.04%、磷酸氢二 钾0.1%、玉米浆2.5-3.5%、磷酸亚铁、硫酸锰各 20ppm、pH7.0 • 一级种子培养：将斜面菌种接入已灭菌冷却的一 级种子培养基中（250ml三角瓶内接入1~2环）于 32℃±1℃、250r.p.m条件下培养12h。 • 一级种子质量要求：种龄12h；pH6.4±0.1；光密 度：净增O.D值0.5以上；无菌检查阴性，噬菌体 检查无。
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谷氨酸的简介
• 谷氨酸，是一种酸性氨基酸。分 子内含两个羧基，化学名称为α氨基戊二酸。谷氨酸是里索逊 1856年发现的，为无色晶体，有 鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶 液，等电点3.22。大量存在于谷 类蛋白质中，动物脑中含量也较 多。谷氨酸在生物体内的蛋白质 代谢过程中占重要地位，参与动 物、植物和微生物中的许多重要 化学反应。
• 每2小时记录发酵过程温度、pH、OD、通风、转速的测定数值，并 记录操作情况。
• OD值测定方法：均匀取样5ml于编号试管中，用空白发酵液稀释至 一定浓度，在722分光光度计上测定A600，根据菌体浓度与吸光度之 间关系的标准曲线换算出菌体浓度；其余发酵于2000r/min条件下离 心分离10min，上清夜入编号三角瓶，用于测糖