葡萄糖氧化酶

葡萄糖氧化酶
一、酶的简介
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称GOD)能够在有氧气的条件下专一性催化β-D- 葡
萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢,高纯度GOD的制剂为淡黄色粉末、易溶于水，完全不溶于乙
醚、氯仿、甘油和乙二醇[1]。

50%丙酮、66%甲醇能使其沉淀。

它广泛地分布于动物、植物和
微生物体内，但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主
要来源，微生物中的主要生产菌株为黑曲霉和青霉。

葡萄糖氧化酶是用黑曲霉等发酵制得的
一种需氧脱氢酶，对人体无毒、副作用，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等功能，它广泛应用
于食品、饲料、医药等行业中，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。

【2】
二、菌种及培养基
2.1 菌种：以黑曲霉H1-9b为菌种，在发酵罐中装入培养基
2.2 发酵培养基(g/L)：蔗糖80、蛋白胨3、KH2PO4 2、MgSO4·7H2O 0.7、KCl 0.5、
NaNO3 4，pH5.5；
斜面培养基(g/L)：蔗糖30、NaNO32、K2HPO41、KCl 0.5、MgSO4 0.5、FeSO40.01、
琼脂20，pH5.5【3】。

发酵条件为：26～29摄氏度，pH值自然，通风量0．3m3／(m3·min)，搅拌速度400r
／min。

发酵液离心分离得菌丝体，经研磨(因葡萄糖氧化酶是一种胞内酶，提取时首先必须
先研磨破壁)后过滤，得到含葡萄糖氧化酶的滤液即酶液。

[4]
三、工艺流程
葡萄糖氧化酶制备流程图
原料预处理培养基配制灭菌
无菌空气制备
发酵产品的分离纯化
菌种的制备和种子培养
葡萄糖氧化酶下游工艺流程图
3.1葡萄糖氧化酶的发酵
3.1.1种子液培养在斜面培养基上接种黑曲霉H1-9b 孢子，28℃培养4 ～5 d 。

3.1.2摇瓶发酵250mL 锥形瓶中分装50mL 发酵培养基，121℃灭菌20min，接种黑曲霉H1-9a 孢子浓度为104个/mL，28℃、200r/min 摇床培养80h 即达产酶高峰。

3.1.3菌丝体的制备摇瓶发酵培养完成后，用纱布过滤发酵液，收集球状菌丝体，用双蒸水将其反复冲洗，直至把发酵液冲干净；再用0.2mol/L pH5.7的磷酸缓冲液冲洗菌丝体，压干水分，称质量后收集备用[5]。

3.2 粗酶液的制备
本实验采用研磨法破碎菌丝体。

将菌丝体置于研钵中，加入适量石英砂，对菌体进行研磨；充分研磨后按1:1(m/V)加入预冷的0.2mol/L pH5.7磷酸缓冲液浸提粗酶，4℃抽提2h。

抽提完成后4℃、12000r/min 离心20min，取上清液，即为粗酶液，透析1d 后收集备用。

3.3 DEAE-Sepharose 离子交换层析
用300mL 0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，取5mL 粗酶液上样，用0～1mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1 的Tris-HCl缓冲溶液配制)进行梯度洗脱，流速0.5mL/min，每管收集5mL，层析完成后收集GOD 活性管，透析脱
盐，冷冻干燥后备用[6]。

3.4 Superdex-200 凝胶过滤层析
用0.05mol/L pH7.1 的Tris-HCl 缓冲溶液平衡Superdex-200 凝胶过滤层析柱过夜，将冷冻干燥后的样品加水稀释至2mL上样，用0.05mol/L pH7.1 的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，流速0.3mL/min，每管收集3mL，层析完成后收集GOD 活性管，透析脱盐，冷冻干燥得到GOD 纯品[7]。

分离纯化步骤说明：分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法很多，包括沉淀法、吸附法、离子交换法、凝胶过滤和亲和色谱等方法，这里先介绍沉淀法和离子交换法。

沉淀法：选择合适的沉淀剂浓度，通过分级沉淀或一步沉淀，可将葡萄糖氧化酶与其他蛋白质初步分开，此法单独使用时提纯效果较差，一般比活性只能提高一倍左右，使用价格便宜且操作简单的沉淀法和吸附法，葡萄糖氧化酶的比活性提高不大；
离子交换法：提纯的葡萄糖氧化酶的比活性(一般为200—250U／mg)较沉淀法和吸附法
为高，产率30％一60％。

离子交换法是较为理想的方法，如Amberlite CG一50树脂对葡萄糖氧化酶具有良好的吸附性，适合于工业规模制备葡萄糖氧化酶[8]。

从整个分离纯化过程看，纯化效果较好，纯化倍数较高。

四、产品检测
1、酶活性测定
邻联茴香胺法[9]
【试剂】
酶：葡萄糖氧化酶浓度为1-4mg/ml
缓冲液：PH6.0 0.1M PB
底物：18％葡萄糖
产物H2O2用偶联的HRP酶反应测定：HRP水溶敝，含60U／m1；1％邻联茴香胺水溶液，临用前取0．1ml、用缓冲液加至12．0ml。

【方法】
在25℃条件下，试验皿中加邻联茴香胺稀释液2．5ml、18％葡萄糖液0．3ml、HRP 水溶液0．1ml、葡萄糖氧化酶液0．1ml，对照皿中加邻联茴香胺稀释液2．6ml、18％葡萄糖液0．3ml、HRP水溶液0．1mI。

记录460nm波长处试验皿中吸光度值的变化，共2—4分钟。

【计算】酶活性(U／mg)=
酶活性单位以每分钟释放1mM H2O2的酶量为萄糖氧化酶活性单位。

2、酶的纯度鉴定
由Superdex-200 凝胶过滤层析纯化的酶液经SDS-PAGE 分析，用考马斯亮蓝R-250 染色，呈现单一条带，说明该酶已经达到电泳纯(图3)。

3、纯化结果及回收率[10]：
2014年9月18日
参考文献
[1]赵晓芳、张宏福等,葡萄糖氧化酶的功能及在畜牧业中的应用[J],广东饲料,2007,16(1):34-35.
[2]刘子宇、李平兰、郑海涛等, 微生物高密度培养的研究进展[J], 中国乳业, 2005, 12: 47-51.
[3]刘峰、黄鹭强、林颖等,从土壤中快速筛选葡萄糖氧化酶产生菌及发酵工艺的优化[J], 生物技术, 2007, 17(3): 64-68.
[4] 张茜、傅婉辉、康劲翮等, 青霉葡萄糖氧化酶的分离纯化及性质研究[J],厦门大学学报: 自然科学版, 2009, 48(1): 99-102.
[5] 刘峰、黄鹭强、林颖等,从土壤中快速筛选葡萄糖氧化酶产生菌及发酵工艺的优化[J], 生物技术, 2007, 17(3): 64-68.
[6] 张龙翔、张庭芳、李令媛等,生化实验方法和技术[M]. 2版,北京: 高等教育出版, 1997: 100-106.
[7] 张婷等,Aspergillius niger Z-25产葡萄糖氧化酶发酵条件优化及酶的分离纯化研究[D], 南京: 南京农业大学, 2008.
[8] 张茜等,尼崎青霉菌葡萄糖氧化酶的分离纯化及性质研究[D], 厦门: 厦门大学, 2009.
[9] SIMPSON C, JORDAAN J, GARDINER N S, et al. Isolation, purifica-tion and characterization of a novel glucose oxidase from Penicillium sp.CBS 120262 optimally active at neutral pH[J]. Protein Expression andPurification, 2007, 51(2): 260-266.
[10]蒋成淦等,酶免疫测定法[M].1版,北京：人民卫生出版社出版, 1984:187-188。