花色素苷生物合成相关基因的研究进展

花色素苷生物合成相关基因的研究进展
张剑亮，王继华，吕冰，安康，曹干
〔广东省农业科学院作物研究所，广东广州510640〕
摘要：
关键词：
类黄酮化合物是植物次生代谢产物的一局部。

类黄酮化合物可以以单体、二聚体和寡聚体的形式存在，几乎分布在植物所有的组织中，但主要在液泡中。

它们也以有色寡聚/多聚分子混合物的形式存在于各种心材和树皮中。

花色素苷是类黄酮类化合物中最重要的一类化合物。

花色素常以苷类形式存在于植物细胞液泡中。

花色素苷除了作为花、果实和种子的主要色素之外，还有其他多种功能。

特异的类黄酮化合物还可以吸收紫外线，使植物免受紫外线B的辐射，从而防止紫外线对植物的伤害〔Ebel and Hahlbrock, 1982〕；参与调节植物对生长素的反响〔Jacobs and Rubery, 1988; Harborne and Williams, 2000〕；具有类似外激素的功能，吸引昆虫授粉。

现今，人们之所以对花色素苷类化合物产生浓厚的兴趣，主要还是因为它给人类的身体健康带来很大的益处。

饮食中的花色素苷类化合物可能对许多疾病具有预防和治疗作用。

许多研究显示花色素苷类合物可以预防中风、抑制肿瘤发育，具有抗炎性，口服花色素苷对糖尿病和溃疡有好处。

花色素苷类化合物作为一类类黄酮，同时也具备类黄酮的一般生理活性。

大量研究已证实红葡萄酒的健康效果〔特别是预防心血管疾病〕与其所含有的花色苷及其聚合物密不可分。

目前市场已出现以花色素苷为主要有效成分的改善视力的功能性或保健食品。

不过，要注意的是不同种类的花色素苷的生理功能定位可能会有所不同。

总之，花色素苷类化合物作为一类功能性基料，在功能性食品领域具有很好的应用前景〔唐传核，2005〕。

1 花色素苷的生物合成途径
花色素苷的生物合成〔图1.2〕是由丙二酰CoA和香豆酰CoA在查尔酮合成酶〔CHS；EC .74〕催化下产生查尔酮开始的。

其中香豆酰CoA是从苯丙氨酸经过多步酶促反响形成的。

苯丙氨酸脱氨酶〔PAL；EC .5〕是这一系列酶反响中的第一个酶。

该酶将苯丙氨酸转化为肉桂酸，将酪氨酸转化为ρ－香豆酸。

该合成途径也是合成其他多种化合物〔如类黄酮、木质素、芪类化合物和香豆素等〕的起始点，因此受到发育和多种外界环境因素的调控。

图类黄酮的生物合成途径〔赵昶灵等，2003〕
Fig Biosynthetic pathway of flavonoids
黄烷酮在黄烷酮-3-羟化酶〔F3H；EC .9〕的催化下，C环第三位置羟化而形成二氢黄酮醇。

该酶在一般条件下不稳定。

由F3H催化所生成的二氢黄酮醇，通常是其他两种酶B－环羟化酶，即二氢黄酮醇3’羟化酶〔F3’H〕和二氢黄酮醇3’5’羟化酶〔F3’5’H〕的底物。

由F3H、F3’H和F3’5’H三种羟化酶所催化反响的产物是合成花色素苷的直接前体。

二氢黄酮醇被羟化的程度和位置不同，将决定最终合成的花色素苷的种类和花的颜色。

如果B环的3’和5’位置都被羟化，二氢黄酮醇将变成二氢杨梅黄酮，这是蓝紫色的翠雀素糖苷的直接前体；如果B环只有3’位置被羟化，将变成二氢栎皮酮，这是红色的花青素糖苷的直接前体；如果3’和5’位置都没有被羟化，那么转变成砖红色的花葵素糖苷。

图1.3 类黄酮化合物生物合成途径中果实中参与花色素和黄酮醇合成的酶类及其大分子复合物模型
A. 产生杨梅素和槲皮素，进而生成翠雀素和矢车菊素来源的花花色素苷模型；
B. 产生槲皮素，进而产生矢车菊素来源的花色素苷模型；
C. 产生山奈素和槲皮素，进而生成天竺葵素和矢车菊素来源的花色素苷模型〔Jaakola et al., 2002〕。

Fig 1.3 Models for the organization of flavonoid pathway enzymes for production of anthocyanidins and flavonols in fruits, supposedly as macromolecular complexes at the endoplasmic reticulum. A, Model for the production of myricetin and quercetin in connection to delphinidin- and cyanidin-derived anthocyanins. B, Model for the production of quercetin in connection with cyanidin-derived anthocyanins. C, Model for the production of kaempferol and quercetin in connection with cyanidin- and pelargonidin-derived anthocyanins (strawberry, raspberry [partially]).
从二氢黄酮醇转变成花色素苷的反响非常复杂，需要几个不同酶的作用。

其中一些已被
证实。

由于这个过程的复杂性和中间产物的不稳定，精确的反响过程还没有完全搞清楚。

二
氢黄酮醇－4－复原酶〔DFR〕是将二氢黄酮醇转变成花色素苷的第一个酶。

该反响需要NADPH，其产物是不稳定的无色花色素。

花色素合成酶〔ANS〕是一个加双氧酶，催化从无色
花色素到花色素的转变。

这个过程还没有完全搞清楚，也许需要第二个酶，可能是个脱氢酶
的作用〔Heller and Ferkmann.,1988〕。

不稳定的花色素形成后，类黄酮－葡糖基转移酶〔UFGT；EC .9〕进一步催化，促使糖苷化转变成稳定的花色素苷。

参与类黄酮化合物生物合成的酶类形成1个多酶复合体，这些复合体以一定的方式排列
并催化生物合成途径中的顺序反响，对于细胞而言，活性位点的中间代谢物的直接转化有利
于提高代谢的效率，原因在于代谢途径中许多分支点上存在对底物的竞争，而中间代谢物极
其活泼并具有潜在的毒性，这些化合物的整体浓度很低，对于细胞而言，它需要对内外的信
号作出快速反响并改变末端产物的种类和数量〔Winkey-Shirley，2001〕。

Jaakola等〔2002〕
比拟完善地描述了这一多酶复合物体系的模型〔图1.3〕。

2 花色素苷生物合成相关基因
花色素苷的生物合成是由许多酶催化完成的。

花色素苷合成途径中几乎所有的基因包括一些调节基因〔如玉米的R和C1〕均已别离。

这些基因可以分成两类，第一类是不同植物种类共同具有的结构基因，第二类是调控结构基因活性、色素空间和时间积累的调节基因。

目前采用转座子标签、PCR扩增与异源杂交、差异cDNA克隆和遗传筛选相结合的方法及实验手段，分别在玉米、金鱼草和矮牵牛等材料中别离克隆到与花色素苷生物合成过程相关的关键酶基因。

2.1 结构基因
结构基因是指不同植物共同具有的直接编码花色素代谢的生物合成酶的基因。

利用转座子标签、PCR扩增、差异杂交、cDNA克隆等方法，已分别在玉米、矮牵牛、金鱼草等大局部植物中克隆出了多个与花色素苷生物合成相关的结构基因，如CHS、CHI、F3H、F3’H、F3’5’H、DFR、ANS以及3GT基因等〔表1.3〕。

表1.3 花色素苷生物合成相关结构基因
Table 1.3 Structural genes of anthocyanin biosynthesis
基因Gene 来源
Taxon
登录号
Accession Number
基因长度〔bp〕
Sequence Length
P AL Arabidopsis thaliana AY092957 2414 Zea mays NM_001111864 2488 Ipomoea nil AF325496 5172 Gerbera hybrid Z38099 244 Vitis vinifera DQ887093 668 Oryza sativa EF576230 445
CHS
A. thaliana NM_121396 1491
Z. mays X60205 3829
I. purpurea U15946 1835
Antirrhinum majus X03710 3574 Chrysanthemum×morifolium DQ521272 1416 V. vinifera EF192464 1182
O. sativa X89859 1606
CHI
A. thaliana NM_126020 696
Z. mays Z22760 2278 I. purpurea AF028238 912
A. majus M68326 667 Chrysanthemum EF094934 720 V. vinifera X75963 979 O. sativa NM_001072119 890
F3’H
A. thaliana AK227152 1362 I. purpurea AB113262 1877
A. majus DQ272592 1981 Chrysanthemum EU286276 580
V. vinifera DQ786632 1887 O. sativa NM_001070873 1863
DFR
A. thaliana NM_123645 1358
Z. mays X05068 4467 I. purpurea AF028601 1306
A. majus X15536 1608 Chrysanthemum EF094935 1143 V. vinifera Y11749 1250 O. sativa AB003496 1480
ANS A. thaliana AY086539 1269 Z. mays X55314 2837 I. purpurea AF028602 1376 V. vinifera EF192468 1144 O. sativa Y07955 1606
UF3GT A. thaliana NM_124785 1491 Z. mays X13502 1594 I. purpurea AF028237 1494 V. vinifera AB047097 1925
PAL是苯丙烷类化合物途径〔也可能是所有次生代谢物代谢途径〕中研究得最详尽的酶。

在某些植物中，PAL似乎只由一个基因编码，而在另一些植物中，那么是由1个多基因家族编码。

菜豆的基因组里面包含了3个PAL基因〔Cramer et al.,1989〕。

Boss等〔1996〕认为在葡萄组织中虽然只有果皮合成花青苷，但PAL基因在大多数器官中均能表达。

这说明PAL所催化的反响并不仅为花青苷合成提供前体，也为其他物质提供前体〔李兴国等，2003〕。

在这个多基因家族中，不同成员的表达特异性不同。

PAL多基因家族成员在表达上的差异是由于它们启动子所包含的cis-elements不同所引起的。

正是由于这些cis-elements和相应的转录因子的共同作用，使得不同的PAL基因能在不同时间和不同组织里表达。

例如，一个只在花里表达的Myb类转录因子与gPAL2启动子的P-box结合后能活化具有花组织特异性〔Sablowski, 1994〕。

CHS酶基因首先是从欧芹属Petroselium hortense中别离出来的〔Krenzaler et al., 1979; Harashima et al., 2003; Huang et al., 2004〕。

很多物种的CHS基因有较高的核苷酸相似性，已构建的CHS基因系统树说明他们可能有共同的起源〔Niesbach-Klõsgen et al., 1987; Yang et al., 2002；Huang et al., 2004〕。

功能上的相似性说明它们可能来自于脂肪酸合酶超基因家族〔Koes et al., 1993〕。

CHS基因家族的进化历程也是一个基因重复的过程。

牵牛的CHS基因在所有已克隆到的CHS基因中进化速率较快〔Durbin et al., 1995; Yang et al., 2004〕。

最早进行花色改进的研究就是选择CHS基因作为调控对象。

对CHS的反义调控使花色素合成被打断而使花色变淡，甚至变成白色或者粉色〔白新祥和戴思兰，2005〕。

CHI基因已分别在豌豆、矮牵牛、苜蓿、翠菊、橙等多种植物中被克隆出来。

在菜豆的
基因组里，只有1个CHI基因〔Mehdy and Lamb,1987〕，其表达能被真菌侵染和机械损伤诱导。

在矮牵牛的基因组里由两个CHI基因〔A和B〕〔van Tunen et al., 1988,1989〕。

CHI-A 基因在花组织和经紫外照射的幼苗〔或实生苗〕里表达。

而CHI-B基因仅在未成熟的花粉中表达。

另外，CHI-A基因的表达与CHS-A和J基因的表达相协调，具有相似的器官和细胞表达特异性。

F3’H已在多种植物如金鱼草、石竹和马鞭草等的花提取液里发现。

F3’H突变会促使花中积累花葵素而非花青素，致使花呈现橙或红色〔孟繁静，2000〕。

目前研究集中于通过把F3’5’H转入一些花卉中以期得到蓝色花〔Fukui et al., 2003〕，而针对F3’H基因的研究相对较少。

但从花色素的合成途径上来看，把正义基因和反义基因结合起来将具有广阔的应用前景，如通过抑制F3’H基因的表达使其产生天竺葵素，创造出新颖的红色花〔于晓南和张启翔，2002〕。

白新祥和戴思兰〔2005〕也提出可以在转入F3’5’H基因的根底上，再用反义技术对F3’H基因进行抑制，从而使花色素合成途径朝飞燕草色素糖苷方向开展。

DFR是花色素苷生物合成下游途径的第一个关键酶。

DFR的主要功能是使二氢黄酮醇〔DHK、DHQ和DHM〕复原为无色花青苷元〔leucoanthocyanidins〕，属于DFR超家族〔Forkmann and Ruhnau，1987；Martens et al., 2002; 刘娟等，2005〕。

利用蛋白质纯化、转座子标签、PCR及鉴别筛选等手段已从拟南芥、玉米、金鱼草、非洲菊、玫瑰、康乃馨等众多植物中众多植物中克隆到DFR基因〔包满珠，1997；O’Reilly，1985；Beld等，1989；Aida等，2000；Krol，1990；Nakatsuka et al., 2003〕。

ANS的作用是将无色花色素苷元氧化，产生有颜色的花色素苷元，对花色素苷的合成起到关键作用(图1.6)〔Saito et al., 1999; Springob et al., 2003〕。

已经从众多植物中克隆到ANS基因。

ANS基因可能属于类似于黄烷酮3β羟化酶〔F3H〕和黄酮醇合成酶〔FLS〕的2-酮戊二酸加氧酶家族(Springob et al., 2003)。

UFGT是花色素苷生物合成过程中的最后一个酶基因，它主要是促使不稳定的花色素转变为稳定的苷类物质。

Kobayashi等〔2002〕在红色葡萄中检测到UFGT基因的表达，并且通过基因序列分析指出，表现型由白色向红色的转变，是控制UFGT基因表达的调节基因作用的结果。

所以UFGT基因的表达在葡萄花色素苷生物合成中具有决定性的作用〔李兴国等，2003〕。

2.2 调节基因
调节基因是指能够影响结构基因的表达方式和表达强度的基因，花色素苷生物合成的每一步酶促反响均是调节基因作用的靶位点。

除了结构基因外，至少还有3类调控基因在调节花色素苷代谢途径的表达，包括MYB基因家族、根本的螺旋-环-螺旋〔bHLH〕类型转录因子和WD40重复蛋白〔表1.4；Springob et al., 2003；黄金霞等，2006〕。

这些基因调节着生物合成酶活性、色素积累基因时空表达。

这些转录因子通过与结构基因启动子中含有的能被其识别的顺式作用元件结合，从而激活花色素苷生物合成途径中多个基因的表达，有效启动花
色素苷生物合成途径。

此外，这些转录因子多数还具有多效性，不仅调控花色素苷的生物合成，同时也参与调节其他的生理过程〔吴江等，2006〕。

表1.4 几种植物中调控花色素苷生物合成的转录因子 Table 1.4 Anthocyanin-regulated transcriptional factors
利用转座子标签技术现已别离出2类花色素苷调节基因，一类是MYC 型转录因子，如玉米的R 基因家族〔R 、S 、Sn 、Lc 基因〕和金鱼草Delila 基因；另一类是MYB 型转录因子，如玉米的C1、P1、P 、Vp1基因。

bHLH 类调控因子的调控目标与MYB 类一样较为广泛，除了类黄酮合成途径外〔Hartmann et al., 2005〕，也参与调控与之无关的途径〔Spelt et al., 2002〕。

其中R /B 基因家族编码的蛋白的局部序列与MYC 原癌蛋白以及哺乳动物的MYC 转录因子的碱性亮氨酸拉链〔bHLH DNA 〕结合域具有同源性〔葛静等，2006〕。

因此局部学者也认为MYC 即为bHLH 类型的转录调节因子〔吴江等，2006〕。

此外，R /B 基因家族编码的蛋白都具有相同的功能，但有不同的组织表达特异性，即可决定种子和植物体中不同部位的色素形成〔葛静等，2006〕。

矮牵牛花中至少有4个调控基因控制花器官中花色素苷合成结构基因的转录，其中an1含有bHLH 结构域，其除了调节花色素苷的生物合成外，还在花瓣细胞液泡的酸化和种皮的上表皮形态建成中起着重要的作用〔Spelt et al., 2002〕。

此外Goodrich 等〔1992〕从金鱼草中克隆到的Delila 基因编码的蛋白也含有bHLH 结构。

WD40重复蛋白在蛋白质与蛋白质的相互作用中担当了重要作用。

Pattanaik 等〔2006〕证实bHLH 转录因子Delila 可
转录因子/编码基因 拟南芥 矮牵牛
金鱼草
玉米
紫苏
大丁草 葡萄 水稻
MYB
TT2 PAP1 PAP2
AN2 AN4
AmMYB305 AmMYB340
C1 P1 P Vp1
MYB-P1 GMYB10 MybA OSB1
MYC （bHLH ） TT8 AN1 JAF3
Delila R B IN1 Lc
MYC-F3G1 MYC-GP/RP
GMYC1
WD40 TTG1 AN11 PAC1 PAC1 WKRY TTG2 锌指蛋白（Wip ） TT1
同源域蛋白
(HD-GL2) ANL2
MADS
TT16
以提高拟南芥CHS基因启动子的活性。

WD40蛋白能够调控叶毛形成和色素合成的信号转导途径，与其他色素调控子相比，WD40蛋白的保守性更强〔葛静等，2006〕。

但这些调控因此如何控制结构基因表达的细节仍有待进一步的研究。

随着研究的深入，逐渐明确了其他与花色形成有关的基因功能，并克隆了局部基因，如从矮牵牛中克隆到7个与pH值有关的基因〔pH1-pH7〕。

这7个基因控制矮牵牛花瓣细胞液的pH值，从而影响花色，其中pH1、pH2和pH6专一影响液泡的pH值〔Vlaming et al., 1983；Griesbach,1998〕。

通过对这些基因位点的反义抑制，就有可能到达提高液泡pH，这对蓝紫色花系的育种将会有很大的帮助〔白新祥和戴思兰，2005〕。

3 花色素苷合成相关基因的表达调控
高等植物花色素苷生物合成由多步酶促反响完成，每一步酶促反响均是调控基因作用的靶位点。

花色素苷生物合成系统是研究基因表达和调控的最正确系统之一。

花色素苷生物合成结构基因和调控基因表达的改变，引起表型改变最终在花的颜色上反映出来。

转录调节是植物花色素苷生物合成途径中调节其结构基因表达的重要环节之一。

这些转录因子单独或协作作用调节花色素苷合成途径中结构基因的表达，从而控制植物体内花色素苷的合成。

通过结构基因酶活性或mRNA表达分析可详细了解带有不同调控基因位点的植物的调节作用部位。

越桔果实成熟过程中果实花色素苷、原花色素及其它类黄酮化合物的积累与花色素苷合成相关基因的表达水平一致〔Jaakola et al.，2002〕。

在角堇发育过程中ANS基因是调控花色变化的关键酶基因之一〔Farzad et al.，2002〕。

CHS与DFR基因由于在蕾期就已激活，因此在角堇个体发育过程中这两个基因均表达，且DFR基因在花发育过程中向上调节花色素苷合成的早期生物合成基因〔Farzad et al.，2003〕。

不同种类植物转录因子调节花色素苷生物合成的作用位点不同。

在玉米上，大约有20个调控基因影响花色素苷产生，其中6个调控基因〔R、B、C1、P1、P和Vp1〕依照其影响结构基因酶活性和mRNA水平而了解其调控功能。

其中除P和Vp1的基因外，它们的调控作用对3-羟基花色素苷具有高度的特异性。

R/B基因对CHS、DFR等基因的表达都是必须的，可以在单子叶和双子叶植物中调控花色素苷的生物合成。

由P基因编码的MYB转录因子其结构域与黄烷酮醇复原酶或DFR启动子A1结合调控玉米仁中3’-脱氧类黄酮和韧皮部色素的合成，这一过程不需要bHLH结构的转录因子协同作用〔Sainz et al., 1997〕。

Vpl对种子的休眠具有多效性和较普遍的作用。

转录因子调控花色素苷生物合成途径CHS与下游DFR、3GT等酶编码基因的表达。

在矮牵牛中，R/B基因家族中的Lc基因对DFR、F3’5’H、ANS、UFGT等基因的激活作用较强，对CHS、CHI和F3H的激活相对较弱，P AL那么不受Lc影响〔Bradley et al., 1998〕。

an1是DFR以及其他花色素苷结构基因组织特异表达的决定性因素〔Spelt et al., 2002〕。

金鱼草AmMYB305、AmMYB340基因的调控表达与玉米中P基因相似，不依赖于bHLH结构的转录因子，调控生物合成途径F3H与下游DFR、ANS、3GT等酶编码基因的表达〔Moyano et al., 1996〕。

欧亚种葡
萄上MYB结构域转录因子通过调控生物合成途径之后期阶段UFGT基因的转录表达参与花色素苷生物合成的调节〔Kobayashi et al., 2002〕；番茄上MYB结构域转录因子那么是通过调控生物合成途径之前期阶段CHS与后期阶段DRF基因的转录表达参与花色素苷生物合成的调节〔Mathews et al., 2003〕。

花色素苷的生物合成更主要的是通过转录因子间的协作而进行的。

由于拟南芥基因组小、冗余性低等特点，有关花色素苷合成的研究较深入，大多数与色素合成有关的突变体都得到了别离与鉴定。

如转录因子TTG2、TT1与TTG1、TT2、TT8一起控制着拟南芥中原花色素的合成；TT2基因编码的MYB蛋白激活后期色素代谢途径，依赖bHLH型转录因子TT8的作用，协作控制DFR和BAN基因的时空表达〔Nesi et al., 2000，2001〕。

在玉米上，MYB 型转录因子C1／P1和bHLH型转录因子R／B协同诱导花色素苷生物合成途径结构基因的表达〔Springob et al., 2003〕。

Selinger等〔1999〕研究还说明转录因子B／C1和P激活花色素苷生物合成结构基因的表达需要P AC1的参与。

在矮牵牛上，色素的生物合成途径至少受到2个转录因子的调节〔Quattrocchio et al., 1993〕，转录因子蛋白质的相互作用对控制花色素苷生物合成结构基因的表达是必需的。

除植物内部的发育信号外，花色素苷的合成过程还受到环境信号因子的调控。

花色素苷的生物合成过程通过这些信号间的复杂互作来实现。

现已证实，赤霉素〔GA3〕、光和糖等信号因子在诱导花色素苷生物合成中也有重要的作用〔许智宏，1998〕。