抗炎机理

中药复方宫炎净的乙醇提取物抗炎作用研究
李效振1 ，贾书红1 ，张东升1，孙跃博1，朱晓庆1，罗燕1，李炳奇2 ，谷新利1*（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003；2.石河子大学化学化工学院，新疆石河子832003）
摘要：为探讨中药复方宫炎净的乙醇提取物抗炎作用，并筛选抗炎作用最好的乙醇提取物剂量。

将实验小鼠分为生理盐水组、地塞米松组、高、中、低剂量中药复方宫炎净乙醇提取物组，同时建立二甲苯所致耳廓肿胀、蛋清所致足趾肿胀、棉球所致肉芽肿小鼠炎症模型，通过测定小鼠耳廓肿胀率、足趾肿胀率以及棉球所致肉芽组织重来判定乙醇提取物的抗炎效果。

结果表明，中剂量乙醇提取物能够显著抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀率，并显著低于高、低剂量乙醇提取物组（P<0.05），与地塞米松组差异不显著（P>0.05）；各组均能明显降低蛋清所致小鼠足趾肿胀率，其中中剂量乙醇提取物组显著低于高、低剂量乙醇提取物组（P<0.05），极显著低于生理盐水组（P<0.01），与地塞米松组差异不显著（P>0.05）；中剂量乙醇提取物能明显抑制棉球所致小鼠肉芽组织增生，并显著低于高、低剂量乙醇提取物组（P<0.05），极显著低于生理盐水组（P<0.01），与地塞米松组差异不显著（P>0.05）。

结果显示中药复方宫炎净的中剂量乙醇提取物抗炎效果最好。

关键词：中药复方宫炎净；乙醇提取物；小鼠；耳廓肿胀率；足趾肿胀率；棉球肉芽肿Study on the Anti-inflammatory effect of Ethanol Extract of Chinese Medicine
Compound Gongyanjing
LI Xiaozhen 1，JIA Shuhong1，ZHANG Dongsheng1，SUN Yuebo1，ZHU Xiaoqing1，
LUO Yan1，LI Bingqi2 and Gu Xinli1*
(1.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi Xinjiang 832003，China；2.College of Chemistry and Chemical Engineering，Shihezi University，Shihezi Xinjiang 832003，China)
Abstract: In order to explore the anti-inflammatory effect of traditional Chinese medicine compound Gongyanping, choose the best anti-inflammatory effects dose of ethanol extract, the experimental mice were divided into normal saline group, dexamethasone group, traditional Chinese medicine Gongyanping net ethanol extract high, medium and low dose group; And to establish ear edema model in mouse induced by xylene, egg white induced paw edema model in mouse and tampons granuloma model in mouse. By measuring the mouse ear swelling rate, toe swelling rate and granulation tissue weight caused by tampons to determine the anti-inflammatory effect of ethanol extract. The results showed that, medium dose ethanol extract could significantly inhibit the xylene-induced ear swelling rate and significantly lower than the ethanol extract of high and low dose group (P <0.05), and compared with the dexamethasone group had no significant difference (P> 0.05); Ethanol extract could significantly reduce the rate of egg white induced paw edema in mice, and the dose of ethanol extract group compared with the saline group were significantly different (P <0.01) and significantly lower than the high and low doses of ethanol extract group (P <0.05), compared with the dexamethasone group had no significant difference (P> 0.05); Ethanol extract could inhibit the proliferation of granulation tissue in mice tampons, compared with the saline group were significantly different (P <0.01), significantly lower than the
收稿日期：2013-09-09
基金项目：新疆兵团科技支疆项目（编号：2013AB010）
作者简介：李效振，男，硕士研究生，研究方向为中草药的开发与利用研究e-mail:lddlxz@。

*通讯作者：谷新利（1963-），男，教授，博士生导师，从事中草药的开发与利用研究；e-mail：xlgu@。

high and low doses of ethanol extract group (P <0.05) compared with the dexamethasone group had no significant difference (P> 0.05). Experimental results show that in traditional Chinese medicine compound Gongyanping dose ethanol extract has the best anti-inflammatory effect.
Key words: Chinese medicine compound Gongyanjing；Extract；Mouse；Ear swelling；Mouse toe swelling rate；Granuloma caused by tampons
奶牛子宫内膜炎是发生于奶牛子宫内膜的炎症，是奶牛产后的常发病之一，也是导致奶牛不育的重要原因之一。

子宫内膜炎常引起奶牛产犊间期延长，产奶量降低，淘汰率增加。

在我国奶牛子宫内膜炎发病率高达20％～50％，新疆石河子市及周边地区成年母牛的子宫内膜炎的平均发病率为22.39%[1]，美国纽约地区的奶牛在产后40~60d期间其发病率为53%[2]。

奶牛子宫内膜炎给奶牛业造成了严重的经济损失，严重制约奶牛业的发展[3]。

目前，治疗奶牛子宫内膜炎药物主要有抗生素、激素、防腐消毒剂和中草药等，临床普遍采用的抗生素治疗发挥了很大的作用，但是治疗成本高，并且随着时间的延长不仅出现了毒副作用和耐药性，而且会造成奶中药物残留，对乳及乳制品安全造成威胁[4]。

而中草药作为天然物质，具有资源丰富、毒副作用小，不产生耐药性等优点，近年来中草药用来治疗奶牛子宫内膜炎越来越受到到人们的青睐[5]。

郭红斌等[6]根据中兽医理论配制加味益母生化栓治疗奶牛子宫内膜炎，肖兵南[7]等采用用益母草、赤芍等13味中草药经水或乙醇提取有效成分配制成复方中药子宫灌注剂“清宫促情灵“治疗各种奶牛子宫内膜炎，疗效显著。

由石河子大学中兽医室研制的中药复方宫炎净是根据中药复方君臣佐使，辩证论治组方原则组合益母草、五灵脂、红花、肉桂等中药研制开发而成，经临床实践证明其对奶牛子宫内膜炎治疗效果显著[8]，但传统散剂用量偏大，不利于临床操作。

因此，本研究用乙醇提取中药复方宫炎净，通过比较不同剂量中药复方宫炎净乙醇提取物对小鼠耳廓肿胀、足趾肿胀率以及棉球肉芽肿的影响，探究抗炎作用最佳的乙醇提取物剂量，为中药复方宫炎净的研究开发奠定一定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
21日龄昆明种健康雌性小鼠150只，购自石河子大学实验动物中心。

1.1.2 实验药物
中药复方宫炎净由益母草、当归、川芎、五灵脂等组成，各单味药均购自石河子市医药公司。

1.1.3 实验药品
体积分数为70%的乙醇提取物（石河子大学化学化工学院提供）；地塞米松磷酸钠注射液(批号1206091，河南润宏制药有限公司)；二甲苯和乙醚均为国产分析纯。

1.1.4 实验仪器
精密电子天平（BS423S，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；TDL-5离心机（Z36 HK，上海安亭科学仪器厂）；循环水式真空泵(SH-C，河南巩义市英峪予华仪器厂)；旋转蒸发器（RE-52，上海亚荣生化仪器厂）；202型电热恒温干燥箱（202-1ES，北京市永光明医疗仪器厂）。

1.2方法
1.2.1 中药复方提取物的制备
取复方宫炎净散剂50g，用70%乙醇浸泡24h后装入玻璃层析柱中，以2mL/s 的速度渗漉48h，期间再加入400mL的70%乙醇。

收集渗漉液，并用旋转蒸发器浓缩至50mL，即相当于原药1g/mL。

1.2.2 实验分组和小鼠耳廓肿胀率测定[9,10]
将50只健康、体重20±2g昆明雌性小鼠随机分为5组，乙醇提取物高剂量组（0.15mL/只）、中剂量组（0.1mL/只）、低剂量组（0.05mL/只）、生理盐水组（给予生理盐水0.1mL/只作为空白对照）、地塞米松组（给予5mg/kg地塞米松磷酸钠注射液），每组10只。

在正常饲喂的基础上，连续灌胃给药4天，最后一次给药1h后，每只小鼠左耳皮肤涂抹0.05mL二甲苯致炎，20min后处死小鼠，用打孔器在小鼠左右耳相同部位打下耳片，于精密电子秤称量重量，计算耳廓肿胀率，肿胀率=（左耳重量-右耳重量）/右耳重量[3]。

1.2.3 实验分组和小鼠足趾肿胀率的测定[3,11]
50只小鼠分组及给药方法同上，在最后一次给药30min后，分别给每只小白鼠右后足用1mL注射器皮下注射1%鸡蛋清致炎，0.03mL/只，4h后处死小鼠，从踝关节处切下两后足于电子秤分别精确测量，计算足趾肿胀率：肿胀率=（右后足重-左后足重-致炎剂重）/左后足重×100%[3]。

1.2.4 棉球肉芽肿的测定[12]
50只小鼠分组及给药方法同上，将棉球（0.005g，实验前以电子天平精确称量，常规高压灭菌后备用），将小鼠用乙醚麻醉后，酒精棉球对手术部位消毒，在无菌条件下用手术刀切开肩胛部皮肤，用手术镊将棉球植入皮下后缝合皮肤，手术后第二天开始给药，连续给药20天，每天1次，最后一次给药1h后颈椎脱臼法处死小鼠，剪开术部皮肤，用手术镊小心取出棉球及周围肉芽组织，置烘干箱在60℃条件下干燥24h，于精密天平准确称量棉球肉芽组织重量。

1.3 统计分析
数据采用SPSS18.0统计软件进行分析，结果用平均数±标准差（Mean±SD）表示。

2 结果与分析
2.1 小鼠耳廓肿胀率测定结果
结果如表1所示：与生理盐水组相比，高、中、低剂量乙醇提取物组均能极显著抑制小鼠耳廓肿胀（P<0.01），并且中剂量乙醇提取物组的抑制效果最好；
高、低剂量乙醇提取物组的小鼠耳廓肿胀率显著高于中剂量乙醇提取物组以及地塞米松组（P<0.05）；中剂量乙醇提取物组的小鼠耳廓肿胀率与地塞米松组差异不显著（P>0.05）。

表 1 各组小鼠耳廓肿胀率
Table 1 The auricle swelling rate of each group in mouse
组别小鼠数量给药方式剂量mL/只肿胀率
乙醇提取物高剂量组10 灌胃0.15 0.587±0.035aA
乙醇提取物中剂量组10 灌胃0.1 0.407±0.031bA
乙醇提取物低剂量组10 灌胃0.05 0.513±0.036aA
生理盐水组10 灌胃0.1 1.340±0.058cB
地塞米松组10 灌胃0.05 0.362±0.022dA
注：数据肩标小写字母不同者表示差异显著（P<0.05）；大写字母不同者表示差异极显著（P<0.01）。

以下表均相同。

Note: The upper right corner of the data marked by different lowercase letters means that it is significant between groups (P<0.05); different uppercase letters means that it is extremely significant between groups (P<0.01).The following tables are the same.
2.2 小鼠足趾肿胀率测定结果
结果如表2所示：与生理盐水组相比，高、中、低剂量乙醇提取物组均能极显著抑制小鼠组织肿胀率（P<0.01），且中剂量乙醇提取物组显著低于高、低剂量乙醇提取物组（P<0.05），高、低剂量乙醇提取物组间差异不显著（P>0.05）；与地塞米松组相比，地塞米松组小鼠足趾肿胀率极显著低于高、低剂量乙醇提取物组（P<0.01），中剂量乙醇提取物组小鼠足趾肿胀率则与地塞米松组比较差异不显著（P>0.05）。

表 2 各组小鼠足趾肿胀率
Table 2 The toe swelling rate of each group in mouse
组别小鼠数量给药方式剂量mL/只肿胀率
乙醇提取物高剂量组10 灌胃0.15 0.085±0.018aB
乙醇提取物中剂量组10 灌胃0.1 0.065±0.016bB
乙醇提取物低剂量组10 灌胃0.05 0.094±0.021aB
生理盐水组10 灌胃0.1 0.133±0.025cA
地塞米松组10 灌胃0.05 0.048±0.014bBC
2.3小鼠棉球肉芽肿测定结果
结果如表3所示：中剂量复方中药宫炎净的乙醇提取物能明显抑制小鼠肉芽组织增生，并极显著低于生理盐水组（P<0.01），显著低于高、低剂量组（P<0.05），高、低剂量中药复方宫炎净的乙醇提取物组与生理盐水组相比差异不显著（P>0.05）；与地塞米松组相比，高、低剂量乙醇提取物组极显著高于地塞米松组（P<0.01），中剂量提取物组与地塞米松组则差异不显著（P>0.05）。

表 3 各组小鼠肉芽组织重
Table 3 The granulation tissue weight of each group in mouse
组别小鼠数量给药方式剂量mL/只肉芽组织重（g）
乙醇提取物高剂量组10 灌胃0.15 0.032±0.003aAC
乙醇提取物中剂量组10 灌胃0.1 0.023±0.001bAB
乙醇提取物低剂量组10 灌胃0.05 0.032±0.003aAC
生理盐水组10 灌胃0.1 0.034±0.004aC
地塞米松组10 灌胃0.05 0.025±0.002bB
3 讨论
中药复方宫炎净组合了益母草、五灵脂、红花、肉桂等多味中药，其中益母草碱可以抗慢性非特异性炎症反应，有效抑制炎性组织增生，当归活血化瘀，川芎理气开郁，桃仁抗炎消肿，五灵脂行血止痛。

以益母草为主药，提高抗炎治疗效果，以抑菌消炎、祛瘀生新、促进生殖机能恢复为原则，有利于减轻机体炎症时脏器的水肿和子宫正常机能的恢复。

3.1 小鼠耳廓肿胀法是目前最常用的筛选新抗炎药的方法，通过对比致炎耳片与正常耳片的重量，计算小鼠耳肿胀度，观察抗炎镇痛药物对致炎液(一般选用巴豆油或二甲苯)致炎的小鼠外耳廓肿胀的抑制作用[13,14]。

二甲苯可以引起局部组织中微血管扩张和通透性增强，使组织液外渗，造成水肿，此外，血管内皮细胞自身的损伤也会引起组织液和血液的外渗[15]。

实验采用二甲苯致炎，观察中药复方乙醇提取物对小鼠耳廓肿胀度的影响。

结果显示中药复方宫炎净的乙醇提取物对阻止二甲苯导致的小鼠耳廓肿胀及降低耳廓肿胀率效果显著，均极显著低于生理盐水组，其中给予0.1mL/只的中剂量组小鼠耳廓肿胀率显著低于0.15mL/只、0.05mL/只两组，且中剂量组与地塞米松组无显著差异，显示乙醇中剂量提取物对抑制小鼠耳廓肿胀效果最佳。

3.2 炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子发生的防御反应，是感染许多疾病的最基本病理过程。

炎症的发生发展过程一般分为3期，早期以毛细血管扩张、通透性亢进为主，中期为血小板吸附及白细胞游走，晚期为肉芽组织增生[16]。

大鼠足趾肿胀模型为一种常用的急性炎性模型，以蛋清作为刺激剂可产生Ⅱ相反应，早期主要由组胺、白三烯、血小板活化因子及环氧化酶参与，后期主要表现为中性白细胞浸润、花生四烯酸释放、自由基产生、及其他嗜中性粒细胞衍生因子的释放[17]。

在用小鼠足趾肿胀率实验中，罗音久等[18]采用小鼠足趾肿胀实验研究紫锥菊根乙醇提取物的抗炎作用；李正国等[3]在中药复方制剂的抗炎作用研究也采用了此方法。

本实验中复方宫炎净高、中、低剂量乙醇提取物均能够有效抑制小鼠耳廓足趾肿胀，均极显著低于生理盐水组，0.15mL/只剂量组和0.05mL/只剂量组与中剂量组给予的0.1mL/只相比差异显著，均显著高于中剂量组，且中剂量组与地塞米松组无显著差异，显示出复方宫炎净中剂量的乙醇提取物对抑制小鼠足趾肿胀具有显著的抑制作用。

3.3 棉球肉芽肿模型是一亚急性（慢性）炎症模型，是局部异物连续刺激所致的迟发性变态反应，表现为肉芽肿的形成[19]。

通过观察药物对肉芽肿重量的影响，
判断其对慢性炎症的抑制效果。

由于肉芽肿增生需要一定的时间，为了准确验证中药复方乙醇提取物的抗炎效果，在本实验中采用了连续灌胃给药20 d的方法。

结果表明，该中药复方乙醇提取物的连续灌胃给药能够明显起到抑制肉芽组织增生的作用，其中中剂量乙醇提取物组小鼠肉芽肿极显著低于生理盐水组、乙醇提取物高剂量组、乙醇提取物低剂量组，且中剂量乙醇提取物对肉芽肿的抑制效果与地塞米松相当，显示其较好的抗炎效果。

3.4 中药的用量是否得当，直接影响药物的疗效[20]。

在一定范围内，药物的效应与靶部位的浓度成正相关，而后者决定于用药剂量或血中药物浓度，药物剂量过小不产生任何效应，随着剂量增加，效应也逐渐增加，但如果达到了最大效能再增加剂量，效应将不再增强[21]。

李正国等[3]采用高（1g/mL）、低(0.5g/mL)不同给药剂量研究中药复方制剂的抗炎效果，并得出高剂量对抵抗不同类型的急慢性炎症抗炎效果极为显著。

黄利权等[22]在火绒草的抗炎活性研究中分别对不同溶剂提取物进行了大（1g/mL）、小(0.5g/mL)剂量分组，最终得出除水煎液小剂量组外，其余各溶剂提取物各剂量均能非常显著的起到抑制炎症的作用。

实验结果表明中剂量中药复方宫炎净的抗炎作用强于高、低剂量组，提示中药复方的剂量影响其疗效，在一定范围内随着剂量增加效果增强，超出高范围，效果则会减弱，其原因还需进一步探究。

4 结论
中药复方宫炎净乙醇提取物对小鼠耳廓肿胀、足趾肿胀、棉球所致肉芽肿具有明显的抑制效果，证实本方可以有效抵抗不同原因引起的急性和慢性炎症，其中以中剂量乙醇提取物效果最佳。

为进一步的临床应用奠定了良好的理论基础。

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