虾青素纳米脂质体及其设备制作方法和应用与相关技术

本技术公开了一种虾青素纳米脂质体及其制备方法和应用。

所述制备方法，包括以下步骤：S1.将虾青素、胆固醇与磷脂溶解于二氯甲烷和三氯甲烷的混合溶液中，振荡充分混合后，减压蒸发除去有机溶剂使溶液形成一层均匀薄膜后，真空干燥；S2.向薄膜中加入缓冲液，将薄膜洗脱并旋转溶解分散均匀，得到虾青素脂质体混悬液；S3.将混悬液避光密封20～30℃放置6～24h后，再用脂质体挤出仪器过膜，即得。

所述虾青素纳米脂质体具有表征特性优良、包封率高、粒径均一、分散性好、稳定性好和抗氧化活性强的特征，显著提高了
对虾特定生长率和成活率、总抗氧化能力和免疫能力，且合成率较高，工艺简单，易于工业化。

权利要求书
1.一种虾青素纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将虾青素、胆固醇与磷脂溶解于二氯甲烷和三氯甲烷的混合溶液中，振荡充分混合后，减压蒸发除去有机溶剂使溶液形成一层均匀薄膜后，真空干燥；
S2.向薄膜中加入缓冲液，将薄膜洗脱并溶解分散均匀，得到虾青素脂质体混悬液；
S3.将混悬液避光密封20～30℃放置6～24h后，再用脂质体挤出仪器过膜，即得。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S1所述胆固醇与磷脂的质量比为1：4～8，优
选为1：5～7，更优选为1：6。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，S1所述虾青素的质量占胆固醇与磷脂总质量的比例为0.5～2.5：210，优选为1：210。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；控制缓冲液pH 为6.0～8.0，优选缓冲液pH为7.0～7.5。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述磷脂为大豆卵磷脂。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2得到虾青素脂质体混悬液后，还对混悬液进行超声处理。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述超声的条件为：超声功率50～70KHZ，超声温度25～30℃，超声时间20～40min。

8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S1控制减压蒸发的条件为：真空度0.08～0.1MPa，温度-10～-13℃；S2控制溶解分散均匀的条件为：温度37～40℃，转速100～
200r/min，时间1～2h。

9.权利要求1～8任一所述制备方法制得的虾青素纳米脂质体，其特征在于，所述脂质体的包封率为83％～95％；粒径大小为100～188nm；分散指数为0.02～0.04。

10.权利要求1～8任一所述制备方法制得的虾青素纳米脂质体在制备虾饲料中的应用。

技术说明书
一种虾青素纳米脂质体及其制备方法和应用
技术领域
本技术属于生物材料技术领域。

更具体地，涉及一种虾青素纳米脂质体及其制备方法和应用。

背景技术
虾青素(Astaxanthin)，分子为C40H52O4，熔点约为224℃，不溶于水，具有脂溶性，易溶于氯仿、丙酮、乙醇、乙醚等大多数有机溶剂，属于叶黄素类β-胡萝卜素家族，在自然界分布较广范。

天然虾青素的自然来源主要来自藻类、酵母、鲑鱼、鳟鱼、虾、龙虾和磷虾等生物体。

其中，雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)为天然虾青素的主要来源。

虾青素具有抗氧化、抗衰老、增强机体抗病能力和着色等生理功效，在畜牧水产、食品药品行业具有广泛的应用前景。

随着全球水产品以每年24％比例递增，虾青素需求量也在不断增加。

但游离的虾青素分子结构不稳定，对光、热、氧气等环境因素极为敏感，容易造成异构化或降解而无法正常发挥其生物学效应。

凡纳滨对虾具有生长速度快、抗逆能力强、饲料转化率高和加工出肉率高等特性，已成为我国对虾养殖的最主要品种之一。

然而，随着养殖密度增大，养殖环境的不断恶化，导致对虾的病害加重，对虾产品的品质降低。

因此，探索一种理化特征良好、抗氧化活性强、稳定性良好的虾青素纳米脂质体是亟待解决的问题。

脂质体(Liposome)是一种人工制备的生物膜，由双亲性物质如磷脂分子构成的内核为水相、具有类细胞膜结构的双层闭合囊泡。

传统的脂质体制备方法有薄膜水化法、乙醚/乙醇注入法、反向蒸发法，以及近年来的后成型加工里使用的高压均质、超声、挤出等。

其中，乙醚/乙醇注入法主要使磷脂能够完全溶解在有机溶液乙醇/乙醚中，之后用注射器的细针头吸取该混合溶液快速注入到大量的PBS缓冲液中，从而形成脂质体。

因操作上比较简单、时效快、方法比较柔和，所以对脂质体所包裹的物质影响较小，已被广泛应用于脂质体的制备。

但是，乙醇、乙醚等有机溶液不易去除，且由于溶解度的因素，使得这种方法制备得到的脂质体包封率比较低。

反向蒸发法则主要是将制备脂质体的原料如磷脂等溶于有机溶剂，然后
将含有包埋物质的水相溶液注入其中，经过一段时间的超声破碎，形成稳定的W/O油包水型乳液，最后再经减压旋蒸等去除有机溶剂的步骤，形成性质良好又低毒的脂质体。

该方法制备的脂质体粒径大小主要受限于所溶解的脂类物质以及所使用的有机溶剂种类。

申请号为201410578096.X的中国技术专利公开了一种虾青素固体脂质纳米粒及其制备方法。

该虾青素固体脂质纳米粒由脂质材料与水相按质量比1：11制成；其中，按质量分数，所述脂质材料中：固体脂1％～15％、植物油85％～98.9％、虾青素0.1％；所述水相中：表面活性剂1％～10％、去离子水90％～99％。

但是这种方法制备得到的脂质体存在包封率比较低(包封率仅为65％～76％)、分散稳定性差(易团聚，沉淀)、易被单核细胞吞噬系统捕获以及靶向性不强等不足。

技术内容
本技术要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种稳定性好、包封率高、粒径均一、分散性好且易被机体有效吸收的虾青素纳米脂质体的制备方法。

本技术的另一个目的是提供一种使用上述方法制备得到的虾青素纳米脂质体。

所述虾青素纳米脂质体，具有表征特性优良(包封率高、粒径均一、分散性好)、稳定性好和抗氧化活性强的特征。

本技术的再一个目的是提供上述制备方法制得的虾青素纳米脂质体在制备虾饲料中的应用。

所述虾青素纳米脂质体显著提高了对虾特定生长率和成活率，显著提高了对虾血清中碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、总抗氧化能力、多酚氧化酶和肝胰腺中溶菌酶活力，显著降低
对虾血清和肝胰腺丙二醛含量；虾青素纳米脂质体可使对虾肠道中的变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度降低，弧菌属(Vibrio)和希瓦氏菌属(Shewanella)的百分比减少。

本技术上述目的通过以下技术方案实现：
一种虾青素纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
S1.将虾青素、胆固醇与磷脂溶解于二氯甲烷和三氯甲烷的混合溶液中，振荡充分混合后，
减压蒸发除去有机溶剂使溶液形成一层均匀薄膜后，真空干燥；
S2.向薄膜中加入缓冲液，将薄膜洗脱并溶解分散均匀，得到虾青素脂质体混悬液；
S3.将混悬液避光密封20～30℃放置6～24h后，再用脂质体挤出仪器过膜，即得。

在本技术较佳的实施例中，S1所述胆固醇与磷脂的质量比为1：4～8，优选为1：5～7，更优选为1：6。

在本技术较佳的实施例中，S1所述虾青素的质量占胆固醇与磷脂总质量的比例为0.5～2.5：210，优选为1：210。

在本技术较佳的实施例中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；控制缓冲液pH为6.0～8.0，优选缓冲液pH为7.0～7.5。

在本技术较佳的实施例中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.02mM。

在本技术较佳的实施例中，所述磷脂为大豆卵磷脂。

在本技术较佳的实施例中，S2得到虾青素脂质体混悬液后，还对混悬液进行超声处理。

在本技术较佳的实施例中，所述超声的条件为：超声功率50～70KHZ，超声温度25～30℃，超声时间20～40min。

在本技术较佳的实施例中，S1控制减压蒸发的条件为：S1控制减压蒸发的条件为：真空度0.08～0.1MPa，温度-10～-13℃。

在本技术较佳的实施例中，S2控制溶解分散均匀的条件为：温度37～40℃，转速100～
500r/min，时间1～2h。

在本技术较佳的实施例中，二氯甲烷和三氯甲烷的混合溶液与缓冲液的体积比为1：4～7。

在本技术较佳的实施例中，二氯甲烷和三氯甲烷的混合溶液中二氯甲烷和三氯甲烷的体积比为1：4。

在本技术较佳的实施例中，S1所述真空干燥条件为：真空度10～11Pa，温度-50～-60℃。

相应地，使用上述制备方法制得的虾青素纳米脂质体，也在本技术的保护范围之内。

所述脂质体的包封率为83％～95％；粒径大小为100～188nm；分散指数为0.02～0.04；Zeta电位为-55.78±1.63mv。

本技术还涉及了上述制备方法制得的虾青素纳米脂质体在制备虾饲料中的应用。

实验发现，所述虾青素纳米脂质体在抗氧化活性、溶水性和稳定性方面都有了很大的改善，且易被机体有效吸收，显著提高了对虾特定生长率和成活率，显著提高了对虾血清中碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、总抗氧化能力、多酚氧化酶和肝胰腺中溶菌酶活力，显著降低对虾血清和肝胰腺丙二醛含量；虾青素纳米脂质体可使对虾肠道中的变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度降低，弧菌属(Vibrio)和希瓦氏菌属(Shewanella)的百分比减少。

与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：
(1)制备的虾青素纳米脂质体把虾青素包封在脂质体内，降低了其对外界环境的敏感度，增强其稳定性，且抗氧化活性高、水溶性好，易于被机体吸收，具有较高的生物利用度。

(2)制备的虾青素纳米脂质体包封率高、粒径均一、分散性好、体外缓释作用好、稳定性高。

(3)制备的虾青素纳米脂质体显著提高了对虾特定生长率和成活率，显著提高了对虾的总抗氧化能力和免疫能力。

(4)虾青素纳米脂质体合成率较高，工艺简单，易于工业化。

(5)反应条件温和，安全环保。

附图说明
图1为虾青素的高效液相检测色谱图。

图2为虾青素的标准曲线。

图3为虾青素纳米脂质体的外观及分散状态；其中，左瓶为虾青素纳米脂质体溶液；中瓶为10倍稀释的虾青素纳米脂质体溶液；右瓶为天然虾青素)。

图4为虾青素纳米脂质体的透射电镜图。

图5为虾青素纳米脂质体的粒径分布。

图6为虾青素纳米脂质体的电位分布图。

图7为虾青素纳米脂质体(ASTL)及虾青素(AST)对DPPH和ABTS清除率比较结果。

图8为虾青素纳米脂质体(ASTL)包封率随时间的变化。

图9为虾青素添加量对包封率的影响。

图10为胆固醇与大豆卵磷脂的比例对包封率的影响。

图11为缓冲液pH对包封率的影响。

具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本技术，但实施例并不对本技术做任何形式的限定。

除非特别说明，本技术采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1一种虾青素纳米脂质体
1、虾青素纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)精密称取虾青素1.0mg，胆固醇与大豆卵磷脂210mg(二者质量比为1：6)；常温下用5mL二氯甲烷和三氯甲烷的混合溶液完全溶解，涡旋振荡至没有不溶物，使用旋转蒸发仪真空低温除去有机溶剂，直至旋转蒸发仪圆底烧瓶瓶壁得到一层均匀的橘红色薄膜，随后将圆底烧瓶放在真空干燥箱真空干燥1h；
(2)取预先配置好的pH＝7.5磷酸盐缓冲液20mL，缓缓倒入圆底烧瓶内，将圆底烧瓶以适当的速度旋转，如此使得烧瓶内壁的物质均匀的溶解在缓冲液中；若有磷脂沉淀，进行超声振荡，即可得到虾青素脂质体混悬液；
(3)将混悬液避光密封，25℃放置6h；然后使用脂质体挤出仪器过膜，即得到虾青素纳米脂质体，4℃冰箱保存。

2、对实施例1得到的虾青素纳米脂质体的理化性质进行研究，包括外观、粒径、电位、包封率和抗氧化活性测定等。

(1)虾青素高效液相检测色谱图及标准曲线见图1和图2。

从图1中可以看出，虾青素的保留时间是4.182min，峰型良好，无拖尾，无杂质峰，表
示虾青素没有发生降解或异构化，虾青素可稳定存在该色谱溶剂中。

在475nm波长处测定不同浓度的虾青素标准品溶液的峰面积值，重复3次，取平均值。

从图2中可以看出，根据所得数据，以浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得到的虾青素的线性回归方程为：Y＝165.4057X+4.3059，R2＝0.9991，因此，虾青素在1.0-5.0μg/mL浓度范围内与峰面积有良好的线性关系。

(2)虾青素纳米脂质体的外观及分散状态观察
将pH7.5的缓冲液加入上述制备的虾青素纳米脂质体分散系，稀释十倍，摇匀后静置15min，同时将与上述虾青素纳米脂质体等量的虾青素标准品置于等量的缓冲液中，以等量的虾青素纳米脂质体溶液作为空白对照，肉眼观察分散系外观，观察有无不溶物形成及其分散情况。

如图3所示，虾青素纳米脂质体分散系样品溶液的外观呈均匀、橘红色的半透明乳液；以制备该脂质体时使用的缓冲液稀释10倍，轻轻摇晃后静置15min，未见固体悬浮物或沉淀出现，呈完全均匀分散分布；而以同样质量的天然虾青素，置于以上相同体积的缓冲液中，轻轻摇匀静置相同时间，天然虾青素难以溶解其中。

(3)虾青素纳米脂质体的透射电镜观察
吸取微量虾青素纳米脂质体滴至载玻片上，加入2％磷钨酸于铜网上负染5min，自然条件下挥发15-20min，透射电镜下观察其形态并拍摄照片。

如图4所示，电子显微镜图像显示虾青素纳米脂质体粒子形态呈球形或者椭球形，分散性良好，粒径几乎一致。

在较大视野内进行观察，视野中无明显杂质干扰，说明虾青素纳米脂质体合成率较高。

随着放大倍数进一步增加，可见虾青素纳米脂质体粒子表面光滑。

(4)虾青素纳米脂质体的粒径大小及分散指数测定
取上述制备得到的虾青素纳米脂质体样品溶液10μL，与990μL超纯水混合均匀，置入聚苯丙乙烯比色杯中，排除气泡，摇匀，用Malvern公司的Nano-ZS90激光粒度测定仪测定虾青素纳米脂质体的粒径大小和粒径分布。

由图5可知，该虾青素纳米脂质体的粒径大小为188.6±2.69nm，分散指数(PDI)为0.02±0.02。

(5)虾青素纳米脂质体的Zeta电位测定
在清洁的聚苯丙乙烯U形管加入1.0mL的上述试验样品溶液，用Malvern公司的Nano-ZS90激光粒度测定仪测定虾青素纳米脂质体的Zeta电位。

由图6可知，该虾青素纳米脂质体的Zeta电位为-55.78±1.63mv，呈负电性。

(6)虾青素纳米脂质体的抗氧化活性试验
1)DPPH自由基清除能力测定
由图7可知，清除等量的DPPH自由基，虾青素纳米脂质体分散系溶液损失了41.36％的虾青素，而虾青素甲醇溶液消耗了占总量83.49％的虾青素；虾青素纳米脂质体和虾青素甲醇溶液对DPPH自由基清除率差异显著(P＜0.05)。

2)ABTS自由基清除能力测定
由图7中的数据及显著性分析可知，清除等量的ABTS自由基，虾青素纳米脂质体分散系
中虾青素减少量占比总量的30.16％，虾青素甲醇溶液中虾青素的减少量占比虾青素总量的65.61％，两者差异显著(P＜0.05)。

(7)虾青素纳米脂质体的保存稳定性试验
将上述制备得到的虾青素纳米脂质体放置在4℃、黑暗的标准大气环境中，储存时长为50d，在保存的第0d、第10d、第20d、第30d、第40d、第50d通过测定虾青素纳米脂质体粒径大小、分散指数、电位以及包封率(EE)，结果见表1及图8。

其中，Wt为每个测定时间段内脂质体包埋的虾青素含量；W0为虾青素纳米脂质体制备当天所包埋的虾青素含量。

表1粒径大小、分散指数、Zeta电位随时间的变化情况
由表1可知，粒径方面，虾青素纳米脂质体在长达50d的保存过程中，粒径有变小的趋势，在保存前30d的时候粒径无显著变化(P＞0.05)，30d之后粒径开始变小，且差异显著(P＜0.05)；分散指数方面，在30d以后的时间段内有显著性的升高(P＜0.05)，但远小于0.3；Zeta电位方面，于第10d发生了显著性的升高(P＜0.05)，且在10d以后40d之前的时间段内，不再发生显著性变化(P＞0.05)，等到第50d的时候，虾青素纳米脂质体粒子所带的电荷量相比较于前30d 的再一次显著的下降(P＜0.05)，但该研究时间段内粒子表面电荷量的绝对值均大于30mv。

同时，由图8可知，从第10d开始，虾青素纳米脂质体包封率显著降低(P＜0.05)，由最初的95.95％下降到了93.38％；第10d到第20d内的包封率没有发生显著性变化(P＞0.05)；第30d到第50d的时间段内，虾青素纳米脂质体的包封率呈显著的下降趋势(P＜0.05)，第50d的时候，包封率下降到87.16％。

在保留率方面，在保存的第10d测定保留率(RR)的变化来描述虾青素纳米脂质体在该环境条件下的保存稳定性能。

实验发现，虾青素纳米脂质体保存第10d后，剩余虾青素依然占比原始含量的84.0％。

实施例2虾青素纳米脂质体制备的优化试验
(1)虾青素用量对脂质体包封率的影响
在实施例1的基础上，以虾青素添加量分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg为单因素变量，胆固醇与大豆卵磷脂的总量为210mg(质量比为1：6)，缓冲液pH为7.5，其他条件不变，按上述实施例1的方法制备虾青素纳米脂质体，考察虾青素添加量对纳米脂质体包封率的影响。

由图9可以看出，当虾青素添加量为1.0mg时，包封率最高，达到94.12％；但当添加量低于1.0mg时，包封率较低；当虾青素添加量超过1.0mg时，包封率呈下降趋势。

(2)胆固醇与大豆卵磷脂的质量比对脂质体包封率的影响
在实施例1的基础上，以胆固醇与大豆卵磷脂的质量比分别为1：4、1：5、1：6、1：7、1：
8为单因素变量，在虾青素加入量为1.0mg，胆固醇与大豆卵磷脂的总量为210mg，缓冲液pH 为7.5条件下，按上述实施例1的方法制备虾青素纳米脂质体，测定包封率，探讨胆固醇与大豆卵磷脂的质量比对脂质体包封率的影响。

由图10可知，当胆固醇与大豆卵磷脂的质量比1：6时，包埋虾青素的效果最佳。

当质量比高于1：6时，随着比值的减小，包封率随之升高，当质量比低于1：6时，随着大豆卵磷脂的含量增加，包封率开始下降。

(3)缓冲液pH对脂质体包封率的影响
在实施例1的基础上，以缓冲液pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0单因素变量，在虾青素加入量为1.0mg，胆固醇与大豆卵磷脂的总量为210mg(质量比为1：6)的条件下，按上述实施例1的方法制备虾青素纳米脂质体，测定包封率，分析缓冲液的pH大小对脂质体包封率的影响。

由图11可知，随着缓冲液pH增大，虾青素纳米脂质体的包封率升高，当pH在6.0～7.0的范围内比较明显，当pH超过7.5时，虾青素纳米脂质体包封率的变化呈下降趋势。

(4)正交试验
在上述单因素试验的基础上，选取虾青素用量、胆固醇与大豆卵磷脂的质量比、缓冲液pH 等3个主要的影响因素，以包封率为指标，进行虾青素纳米脂质体制备的正交试验。

正交试验设计见表2。

表2正交试验因素水平表
由表3可知，对虾青素纳米脂质体包封率影响因素大小顺序为B(胆固醇与大豆卵磷脂的质量比)>C(缓冲液pH)>A(虾青素的添加量)。

最佳组合为A1B1C1，即虾青素的用量为1.0mg，胆固醇：大豆卵磷脂＝1：6，缓冲液pH为7.0，该组条件下包封率为92.18％，为最优试验组。

根据k值，最优组合为A1B1C3。

将A1B1C3组合进行了3次平行验证试验，得到的平均包封率为95.96％，大于正交试验A1B1C1组合条件下的包封率，说明A1B1C3组合优于A1B1C1组合。

因此可确定虾青素使用量为1.0mg，胆固醇与大豆卵磷脂的质量比为1：6，缓冲液pH为7.5的条件下虾青素纳米脂质体的包封率最大，制备效果最佳。

表3正交试验设计及结果
实施例3虾青素纳米脂质体对凡纳滨对虾生长和免疫的影响
(1)试验分组与处理
选用外观正常、体质健壮、初始体重0.3±0.01g的幼虾，随机分配到12个250L的养殖桶中，分别为空白对照组(B组)、添加虾青素组(AST组)、添加空白脂质体组(BL组)和添加实施例1的虾青素纳米脂质体组(ASTL组)等4个处理组；每个处理组设3个重复，每个重复35尾虾，饲养周期43d。

B组对虾饲喂基础饲料，AST组、BL组和ASTL组对虾分别饲喂含有虾青素、空白脂质体
及虾青素纳米脂质体的基础饲料；采用喷涂、搅拌的方式将空白脂质体、虾青素和虾青素纳米脂质体分别添加到基础饲料中；AST组和ASTL组的虾青素添加量均是1kg饲料中含有
80mg虾青素，空白脂质体的添加量同ASTL组。

(2)各饲料组凡纳滨对虾的生长性能
由表4可知，饲喂四种不同的饲料，空白对照组、各试验组在增重率和饲料效率方面无显著差异；在对虾特定生长率方面，AST、ASTL组均显著高于B组和BL组(P＜0.05)，AST、ASTL饲料组两者组间差异不显著(P＞0.05)，B组和BL组组间无显著差异(P＞0.05)；在成活率方面，ASTL组的成活率最高，为83.83％，且显著高于B组、AST组和BL组；饲喂ASTL饲
料显著提高了凡纳滨对虾的成活率，其他各饲料组组间比较无显著差异(P＞0.05)。

表4各饲料组凡纳滨对虾的生长性能
(3)对虾血清免疫指标测定
各饲料组对虾血清免疫指标测定结果见表5。

由表5可知，在对虾血清免疫酶活性方面，与B 组相比，各试验组凡纳滨对虾血清中的酸性磷酸酶(ACP)活性、溶菌酶(LZM)活性无显著差异(P＞0.05)；ASTL组对虾血清中的碱性磷酸酶(AKP)活性显著高于其他各饲料组(P＜0.05)，活性值为17.65(金氏单位/100mL)，其余各试验组之间无显著差异(P＞0.05)。

表5各饲料组对虾血清免疫指标
实验还发现，本技术的虾青素纳米脂质体显著提高了对虾特定生长率和成活率，显著提高了对虾血清中碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、总抗氧化能力、多酚氧化酶和肝胰腺中溶菌酶活力，显著降低对虾血清和肝胰腺丙二醛含量；虾青素纳米脂质体可使对虾肠道中的变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度降低，弧菌属(Vibrio)和希瓦氏菌属(Shewanella)的百分比减少。

申请人声明，以上具体实施方式为便于理解本技术而说明的较佳实施例，但本技术并不局限于上述实施例，即不意味着本技术必须依赖上述实施例才能实施。

所属技术领域的技术人员应该明了，对本技术的任何改进，对本技术所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本技术的保护范围和公开范围之内。