植物次生代谢物的提取分离

植物次生代谢物的提取分离

实验一银杏叶黄酮类化合物提取及含量的测定

一、实验目的

1.通过本实验学习植物黄酮类化合物提取的一般方法

2.学习植物叶片黄酮类化合物含量测定的方法

3.学习利用薄层色谱法鉴别黄酮类化合物

二、基本原理

(1)黄酮类化合物的提取

银杏叶(Ginkgo biloba L.)中黄酮类化合物有特殊的药效，黄酮类化合物(flavonoids) 主要是指两个苯环（A-与B-环）通过中央三碳链相互连接而成的一系列化合物，其基本骨架为C6-C3-C6，母体结构式如下：

O A B

C

是植物次生代谢产物之一，普遍存在于维管植物中, 大部分以苷的形式存在，一部分以游离形式存在，种类较多，分布广泛，已发现的天然黄酮类化合物有十多个大类3000多种。黄酮类化合物具有明显的生物活性，如对心血管系统有明显的药理作用以及抗肝脏毒性作用等。

黄酮类化合物的提取主要是根据被提取物的性质及伴存的杂质来选择适合的提取溶剂，苷类和极性较大的苷元，一般用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水或某些极性较大的混合溶剂(如甲醇－水：1∶1)进行提取。大多数苷元宜用极性较小的溶剂如乙醚、氯仿、乙酸乙酯等来提取。但乙醇和甲醇是最常用的黄酮类化合物的提取溶剂。

(2)黄酮类化合物含量的测定

大部分黄酮类化合物分子结构中含有－OH和C＝O，所以可以和铝离子络合形成有色物质，这些有色物质在400~500nm有吸收现象，据此可以采用硝酸铝比色法来测定黄酮类化合物的含量。

(3)黄酮类化合物的薄层层析

薄层层析是检验黄酮类化合物是否存在的强有力的方法，通常用的薄层层析技术有纸层析、聚酰胺薄层层析、硅胶薄层层析、氧化铝薄层层析技术等，其中

纸层析、聚酰胺薄层层析技术对黄酮类化合物的分离方法较好。黄酮类化合物在层析材料上展开后，经过1%的AlCl3溶液显色后在365nm紫外灯下即可观察到颜色斑点。通常在纸层析上观察到的是棕色斑点，在聚酰胺薄层层析上观察到的是黄色或黄绿色斑点。

三、实验所需试剂、仪器及材料

(1)试剂

70%(v/v)的乙醇、正丁醇、冰醋酸、石油醚、氯仿、甲醇、1%(w/v)的AlCl3溶液、10% (m/m)的Al(NO3)3溶液、5% (m/m)的NaNO2溶液、4%的NaOH溶液、芦丁。

(2)仪器

365nm紫外分析仪、分光光度计、旋转蒸发器、真空泵、水浴锅、层析缸、容量瓶、10ml具塞刻度试管、烧瓶、冷凝管、喷壶、毛细管、布氏漏斗及其他必备玻璃仪器。

(3)材料

滤纸或聚酰胺薄膜。

四、实验步骤

1. 银杏叶黄酮类化合物的提取及薄层定性检测

(1) 准确称取10g银杏叶干粉，用石油醚反复浸提2次以除去叶绿素及其它干扰

含量测定的脂溶性杂质，每次30min，然后过滤；

(2) 将石油醚浸提后的银杏叶全部转入150ml的烧瓶中，按物料比为1∶10再加

入100ml 80%(v/v)的乙醇水域加热回流提取40min；

(3) 将提取液抽滤后浓缩定容至10ml。

(4) 以芦丁为对照，用玻璃毛细管点银杏提取液浓缩样于聚酰胺薄膜上，以氯

仿∶甲醇＝8∶2上行展开，以1％的三氯化铝乙醇溶液显色并置于紫外分析仪（365nm）下观察；

(5) 如果实验室没有聚酰胺薄膜材料，也可以用纸层析代替，具体做法与用聚酰

胺薄膜材料相似，唯一的区别是展开剂不同，纸层析采用正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2展开系统。

2. 银杏叶黄酮类化合物含量的测定

(1) 工作曲线的绘制

a. 精密称取芦丁样品（在120℃烘干至恒重）5mg，用50%乙醇溶解定容至50mL得以芦丁为标准的标准溶液；

b. 分别取2、4、6、8、10ml芦丁溶液置于25ml容量瓶中，再分别吸取1ml 置于10ml刻度试管中，采用硝酸铝比色法进行显色测定；

c. 精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀放置5min，再精密加入10%硝酸铝溶液0.3mL摇匀放置5min，最后加入1 moL/L氢氧化钠溶液4.0mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀放置15min，于510nm（在400～520nm间经扫描，确定510nm 处为最大吸收波长）波长处比色测定，同时做空白对照，重复三次，绘制标准曲线并计算回归方程。

(2) 银杏叶提取液黄酮类化合物含量的测定

a. 吸取1mL提取液的浓缩液于10ml刻度试管中，按工作曲线的制作方法来测定溶液的吸光度值；

b. 用所得工作曲线的方程来计算总黄酮的含量。

思考题：

1.用硝酸铝比色法测定植物黄酮类化合物含量的原理是什么？

2.为何测定植物叶片黄酮类化合物的含量时最好先用石油醚浸提？

实验二银杏叶黄酮类化合物的初步分离

一、实验目的

1. 通过本实验学习黄酮类化合物的初步分离即黄酮类化合物与非黄酮类化合

物的分离方法

3. 学习利用柱色谱技术来分离植物叶总黄酮的方法

二、基本原理

黄酮类化合物的分离包括黄酮类化合物与非黄酮类化合物的分离，以及黄酮类化合物单体的分离。银杏叶片非黄酮类化合物主要包括脂类、水溶性物质如蛋白质、多糖等以及其他种类的次生代谢物，根据这些特点，常采用的初步分离方法有：溶剂萃取法，常用的萃取溶剂有乙酸乙酯、乙醚、正丁醇等，通常这些溶剂萃取法初步将黄酮类化合物分成几个极性部分；聚酰胺柱吸附法，这是利用大多数黄酮类化合物具有酚羟基，可被聚酰胺吸附，因此即可将其与不含酚羟基的化合物分离；此外，目前常用的还有D－101大孔树脂吸附法，主要是利用大孔树脂的多孔性特点进行分离的，采用不同极性的溶剂进行洗脱，即可得到粗黄酮类化合物产品。

三、实验所需试剂、仪器及材料

(4)试剂

70%(v/v)的乙醇、正丁醇、冰醋酸、氯仿、甲醇、5%的α－萘酚乙醇溶液、0.1%的印三酮乙醇溶液、1%(w/v)的AlCl3溶液、芦丁。

(5)仪器

低速离心机、365nm紫外分析仪、旋转蒸发器、真空泵、水浴锅、层析缸、容量瓶、喷壶、毛细管、层析柱、三角瓶等其它必备玻璃仪器。

(6)材料

D－101大孔吸附树脂、滤纸或聚酰胺薄膜。

四、实验步骤

1. 银杏叶黄酮类化合物的提取液浸膏的制作

(1) 准确称取10g银杏叶干粉，用石油醚反复浸提2次以除去叶绿素及其它干扰

含量测定的脂溶性杂质，每次30min，然后用80%的乙醇热水回流提取40min