封闭式光生物反应器中三角褐指藻的高密度培养
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１０Ｌ光反应器中分批补料培养生长曲线
—２６８． １９９６，２６６
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１材料与方法
１．１藻种
本文使用的三角褐指藻由中国水产科学院黄海水产研究所提供。
１．２培养基
本文主要使用了两种培养基：一为育苗场原有培养基（以下简称育苗场培养基），二为本实验室自行优化所得的培养基 （以下简称优化后培养基，详见另文发表）。
１．３培养系统
培养系统采用了华东理工大学海洋生化工程研究所自行研制的２Ｌ及１０Ｌ圆柱型气升式光生物反应器。
基金项目：国家８６３计划海洋生物技术主题资助课题（２００２ＡＡ６０３０１５） －通讯作者：Ｆ．ｚｎａｉｈ ｙ班＠鳓城．ｅｄｅ．∞ ・１７３・
第一届海洋生物高技术论坛论文集
２结果与讨论Biblioteka ２．１优化后培养基与育苗场培养基的分批培养比较【２，５】
培养基优化是饵料微藻培养工艺优化的基础，通常饵料微藻培养的－
・１７４・
ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ２Ｌ ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ
第一届海洋生物高技术论坛论文集
４０％，２４ｈ后再补充磷酸二氢钾。培养时先进行分批补料培养，然后进行半连续培养。其中分批补料培养培养基的补加按２．２ 节所述策略进行。上述半连续培养的结果如图５所示。由图可知，三个半连续培养周期内藻细胞平均每天增长１５５０万／ｍＬ， 此结果比分批补料培养平均日产率１１６０万／ｍＬ约高出３３．５％。说明半连续培养能带来更高的日产率。
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指藻平均日产率可达１５５０万／Ⅱ虬是同样反应器中分批补料培养的１．３３倍。 参考文献
［１］粱英．不同的营养盐浓度对三角褐指藻生长的影响［Ｊ］．海洋湖沼通报，１９９９，４：４３—４７． ［２］朱艺风．半连续培养氮磷浓度，更新率对三角褐指藻采收量的影响［Ｊ］．海洋科学，２０００，２４（１１）：３５—３８． ［３］陈佳荣主编．水化学实验指导［Ｍ】．北京：中国农业出版社，１９９６．１１８—１３１． ［４３ｒ Ｒ帕森斯著．海水分析的化学和生物学方法［Ｍ］．陈慈美等译．厦门：厦门大学出版社，１９９１．２４—２７． ［５］林霞．氮磷铁营养浓度对不同品系三角褐指藻生长影响的比较研究［Ｊ］．浙江海洋学院学报，２０００，１９（４）：３８４—３８７． ［６］Ｊ Ｆａｂｒｅ８瑚，ｅｔ ａｉ．０一Ｔｎｄ ｒｅｎｅｖａｄ ｒａｔｅ ａｎｄ ｍｌｔｎｅａｔ硼袱ｍ砸ｍ ｉｎ ｍｒ／ｃｏｍｉｍａｍｅ ａｌｌａｎｚｓ［Ｊ】．Ａｐｐｕｅｄ Ａｎｄ Ｅａｖｉｍａｍａｔａｌ Ｍｉｃａｄａｉｄｏ留，Ｊａｎ
时间（ｈ）
图２
２Ｌ光反应器中分批培养过程营养盐的消耗
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减缓后（约１７２ｈ），再次补加３０ｒａｇ磷酸二氢钾（浓缩液）。经过两次补磷 后，三角褐指藻的细胞密度快速升高，培养２１６ｈ，藻细胞密度达到１０４４０ 万／ｍＬ。平均日产率可达１１６０万／ｍＬ，获得了较高的生产效率。但此后 再次补充同样最的磷酸二氢钾，藻细胞密度不再快速生长，而补充了硝
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酸钠后，藻细胞又可以继续生长，但生长速率仍较低，考虑到培养后期如果再继续＊ｌ，／Ｊｎ较多量的营养盐将造成藻细胞的得率 降低，增加生产的成本，同时不利于投饵，因此不再继续补料．
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２Ｌ光反应器中的分批补料培养
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２Ｌ光反应器中优化前后 培养基分批培养比较
图２为２Ｌ反应器中以优化后培养基进行分批培养时硝酸钠和磷酸 二氢钾的消耗情况，从这两种主要营养成分的消耗情况看，硝酸钠在分批
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长速率略低于２Ｌ光反应器，因此第一次补磷时间与２Ｌ反应器相比推
迟了约ｌＯｈ，经过１３１ｈ和２１６ｈ两次补磷，每次补磷酸二氢钾１５０ｍｇ（浓 缩液）。三角褐指藻培养２４０ｈ，藻细胞密度达到８３２０万／ｍＬ，平均日产 率为８３２万／ｍＬ。获得了较好的放大结果。
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１．４培养条件
培养温度（２０±２）℃、初始ｐＨ ８．０，２Ｌ反应器通气量约０．６ Ｌ／ｎ－五ｎ，１０Ｌ反应器通气量约３—５Ｌ／ｒａｉｎ、接种浓度３００×１０＇个／ 脚Ｌ，培养采用连续光照，由反应器自带荧光灯光源提供。 １．５测定方法 硝酸盐（指硝酸根的氮原子，用Ｎ伤一一Ｎ表示）测定采用锌一镉还原法，磷酸盐（用Ｐ０４３一一Ｐ表示）测定采用抗坏血酸还 原的磷钼蓝法【３．４３。细胞数测定采用血球计数法测定。
２６４
时删（ｈ）
２Ｌ光反应器中的半连续培养［２・６・７】
图３
２Ｌ光反应器中分批补料培养生长曲线
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由图３可知，当藻细胞浓度达约４０００万／ｍＬ后的２ｄ内藻细胞产 率较大，故半连续培养的起始藻细胞浓度确定为４０００万／ｍＬ，以含Ｏ．５ 倍浓度初始培养基的海水换液，换液周期为２ｄ，换液的体积比约为
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・１７６・
图５半连续培养藻细胞密度随时间变化曲线
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ｅｕｌｔＩｌｘｅ ｉｎ １０Ｌ ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｅｔｏｒ
３结论
（１）磷缺乏可能是限制三角褐指藻进一步生长的主要原因； （２）在２Ｌ光反应器中，以优化后培养基为基础进行的分批补料培养，三角褐指藻的藻细胞密度２１６ｈ可达１０４４０万／ｍＬ，平 均日产率可达１１６０万／ｍＬ；放大到１０Ｌ光反应器后，培养２４０ｈ，藻细胞密度可达８３２０万／ｍＬ，平均日产率为８３２万／ｍＬ。 （３）２Ｌ光反应器中的半连续培养可以达到比分批补料培养更高的产率。在换液周期２ｄ，换液体积４０％的条件下，三角褐
菲律宾蛤仔是我国四大养殖贝类之一。饵料微藻持续、稳定供给是菲律宾蛤仔工厂化育苗过程顺利进行的重要基础。 三角褐指藻是菲律宾蛤仔育苗中使用的饵料藻种之一，具有营养丰富、耐低温、生长繁殖快的特点ｕ．２Ｊ，同时也是春季各种贝 类育苗生产中最常用的单胞藻。目前三角褐指藻在育苗场大多采用三角瓶、吊袋、水泥池培养，但由于培养设备和培养工艺 落后，藻细胞生长较慢、藻细胞密度低，导致育苗场时常出现三角褐指藻供应不足的现象，从而影响育苗的产量。本文以封闭 式光生物反应器作为培养系统，进行三角褐指藻分批补料培养和半连续培养工艺研究，以期建立一套三角褐指藻的高效培养 工艺，为菲律宾蛤仔的工厂化育苗提供充足的饵料。
・１７５・
繁一缓海洋生物鸯技术论坛论文集
Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｃｕｔｉｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ＴｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍＩｎ Ｅｎｃｌｏｓｅｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ
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封闭式光生物反应器中三角褐指藻的高密度培养
程鑫１，李元广”，沈国敏１，张静霞１，方建光２
（１．华东理工大学海洋生化工程研究所，生物反应器国家重点实验室，上海２００２３７
２．中国水产科学院黄海水产研究所，山东青岛２６６０７１）
摘要在２Ｌ光生物反应器中以优化后培养基为基础进行三角褐指藻的培养。分批补料培养２１６ｈ 的藻细胞密度达到１０４４０万／ｍＬ，平均日产率可达１１６０万／ｍＬ；该培养工艺放大到１０Ｌ光反应器中培养 ２４０ｈ的藻细胞密度可达８３２０万／ｍＬ，平均日产率为８３２万／ｍＬ。在换液周期为２ｄ、换液体积为４０％的条件 下，２Ｌ光反应器中半连续培养时的藻细胞平均生长速率达到１５５０万／ｍＬ。 关键词光生物反应器；三角褐指藻；高密度培养
营养组成都较简单，主要包括碳、氮、磷及微量元素等，但各种营养盐的浓墨
度需经过优化组合，以适应不同微藻的需要。图１为２Ｌ光生物反应器中。
三角褐指藻分别在优化后培养基与育苗场培养基中分批培养时的生长曲篓
线。从图中可以看出，优化后培养基更适合三角褐指藻的生长，培养到器 ４８ｈ后，优化后培养基的生长速率就开始明显高于育苗场培养基，优化后 培养基分批培养１０８ｈ的细胞密度达最高，其值为４３５５万／ｍＬ，而育苗场 培养基培养９６ｈ的细胞密度达最高，其值为２６７２万／ｍＬｏ优化后培养基 最高藻细胞密度为育苗场培养基的１．６３倍。
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１０Ｌ光反应器中分批补料培养生长曲线
—２６８． １９９６，２６６
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１材料与方法
１．１藻种
本文使用的三角褐指藻由中国水产科学院黄海水产研究所提供。
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培养系统采用了华东理工大学海洋生化工程研究所自行研制的２Ｌ及１０Ｌ圆柱型气升式光生物反应器。
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第一届海洋生物高技术论坛论文集
２结果与讨论Biblioteka ２．１优化后培养基与育苗场培养基的分批培养比较【２，５】
培养基优化是饵料微藻培养工艺优化的基础，通常饵料微藻培养的－
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第一届海洋生物高技术论坛论文集
４０％，２４ｈ后再补充磷酸二氢钾。培养时先进行分批补料培养，然后进行半连续培养。其中分批补料培养培养基的补加按２．２ 节所述策略进行。上述半连续培养的结果如图５所示。由图可知，三个半连续培养周期内藻细胞平均每天增长１５５０万／ｍＬ， 此结果比分批补料培养平均日产率１１６０万／ｍＬ约高出３３．５％。说明半连续培养能带来更高的日产率。
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［１］粱英．不同的营养盐浓度对三角褐指藻生长的影响［Ｊ］．海洋湖沼通报，１９９９，４：４３—４７． ［２］朱艺风．半连续培养氮磷浓度，更新率对三角褐指藻采收量的影响［Ｊ］．海洋科学，２０００，２４（１１）：３５—３８． ［３］陈佳荣主编．水化学实验指导［Ｍ】．北京：中国农业出版社，１９９６．１１８—１３１． ［４３ｒ Ｒ帕森斯著．海水分析的化学和生物学方法［Ｍ］．陈慈美等译．厦门：厦门大学出版社，１９９１．２４—２７． ［５］林霞．氮磷铁营养浓度对不同品系三角褐指藻生长影响的比较研究［Ｊ］．浙江海洋学院学报，２０００，１９（４）：３８４—３８７． ［６］Ｊ Ｆａｂｒｅ８瑚，ｅｔ ａｉ．０一Ｔｎｄ ｒｅｎｅｖａｄ ｒａｔｅ ａｎｄ ｍｌｔｎｅａｔ硼袱ｍ砸ｍ ｉｎ ｍｒ／ｃｏｍｉｍａｍｅ ａｌｌａｎｚｓ［Ｊ】．Ａｐｐｕｅｄ Ａｎｄ Ｅａｖｉｍａｍａｔａｌ Ｍｉｃａｄａｉｄｏ留，Ｊａｎ
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２Ｌ光反应器中优化前后 培养基分批培养比较
图２为２Ｌ反应器中以优化后培养基进行分批培养时硝酸钠和磷酸 二氢钾的消耗情况，从这两种主要营养成分的消耗情况看，硝酸钠在分批
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ＩＯＬ光反应器中的分批补料培养
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器，同样以优化后的培养基进行三角褐指藻的培养，温度２２℃，初始ｏ
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１０４个／ｍＬ，培养采用连篓…”
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１．４培养条件
培养温度（２０±２）℃、初始ｐＨ ８．０，２Ｌ反应器通气量约０．６ Ｌ／ｎ－五ｎ，１０Ｌ反应器通气量约３—５Ｌ／ｒａｉｎ、接种浓度３００×１０＇个／ 脚Ｌ，培养采用连续光照，由反应器自带荧光灯光源提供。 １．５测定方法 硝酸盐（指硝酸根的氮原子，用Ｎ伤一一Ｎ表示）测定采用锌一镉还原法，磷酸盐（用Ｐ０４３一一Ｐ表示）测定采用抗坏血酸还 原的磷钼蓝法【３．４３。细胞数测定采用血球计数法测定。
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２Ｌ光反应器中的半连续培养［２・６・７】
图３
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由图３可知，当藻细胞浓度达约４０００万／ｍＬ后的２ｄ内藻细胞产 率较大，故半连续培养的起始藻细胞浓度确定为４０００万／ｍＬ，以含Ｏ．５ 倍浓度初始培养基的海水换液，换液周期为２ｄ，换液的体积比约为
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图５半连续培养藻细胞密度随时间变化曲线
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ｅｕｌｔＩｌｘｅ ｉｎ １０Ｌ ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｅｔｏｒ
３结论
（１）磷缺乏可能是限制三角褐指藻进一步生长的主要原因； （２）在２Ｌ光反应器中，以优化后培养基为基础进行的分批补料培养，三角褐指藻的藻细胞密度２１６ｈ可达１０４４０万／ｍＬ，平 均日产率可达１１６０万／ｍＬ；放大到１０Ｌ光反应器后，培养２４０ｈ，藻细胞密度可达８３２０万／ｍＬ，平均日产率为８３２万／ｍＬ。 （３）２Ｌ光反应器中的半连续培养可以达到比分批补料培养更高的产率。在换液周期２ｄ，换液体积４０％的条件下，三角褐
菲律宾蛤仔是我国四大养殖贝类之一。饵料微藻持续、稳定供给是菲律宾蛤仔工厂化育苗过程顺利进行的重要基础。 三角褐指藻是菲律宾蛤仔育苗中使用的饵料藻种之一，具有营养丰富、耐低温、生长繁殖快的特点ｕ．２Ｊ，同时也是春季各种贝 类育苗生产中最常用的单胞藻。目前三角褐指藻在育苗场大多采用三角瓶、吊袋、水泥池培养，但由于培养设备和培养工艺 落后，藻细胞生长较慢、藻细胞密度低，导致育苗场时常出现三角褐指藻供应不足的现象，从而影响育苗的产量。本文以封闭 式光生物反应器作为培养系统，进行三角褐指藻分批补料培养和半连续培养工艺研究，以期建立一套三角褐指藻的高效培养 工艺，为菲律宾蛤仔的工厂化育苗提供充足的饵料。
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繁一缓海洋生物鸯技术论坛论文集
Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｃｕｔｉｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ＴｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍＩｎ Ｅｎｃｌｏｓｅｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ
（ｍ嘻妇ｏｆＭａｒｉｎｅ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ踟咖嘲，Ｓｔａｔｅ脚Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＢｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ
封闭式光生物反应器中三角褐指藻的高密度培养
程鑫１，李元广”，沈国敏１，张静霞１，方建光２
（１．华东理工大学海洋生化工程研究所，生物反应器国家重点实验室，上海２００２３７
２．中国水产科学院黄海水产研究所，山东青岛２６６０７１）
摘要在２Ｌ光生物反应器中以优化后培养基为基础进行三角褐指藻的培养。分批补料培养２１６ｈ 的藻细胞密度达到１０４４０万／ｍＬ，平均日产率可达１１６０万／ｍＬ；该培养工艺放大到１０Ｌ光反应器中培养 ２４０ｈ的藻细胞密度可达８３２０万／ｍＬ，平均日产率为８３２万／ｍＬ。在换液周期为２ｄ、换液体积为４０％的条件 下，２Ｌ光反应器中半连续培养时的藻细胞平均生长速率达到１５５０万／ｍＬ。 关键词光生物反应器；三角褐指藻；高密度培养
营养组成都较简单，主要包括碳、氮、磷及微量元素等，但各种营养盐的浓墨
度需经过优化组合，以适应不同微藻的需要。图１为２Ｌ光生物反应器中。
三角褐指藻分别在优化后培养基与育苗场培养基中分批培养时的生长曲篓
线。从图中可以看出，优化后培养基更适合三角褐指藻的生长，培养到器 ４８ｈ后，优化后培养基的生长速率就开始明显高于育苗场培养基，优化后 培养基分批培养１０８ｈ的细胞密度达最高，其值为４３５５万／ｍＬ，而育苗场 培养基培养９６ｈ的细胞密度达最高，其值为２６７２万／ｍＬｏ优化后培养基 最高藻细胞密度为育苗场培养基的１．６３倍。