酵母双杂交系统技术介绍

GGG CCC
GGG CCC
AAAAAAAAA TTTTTTTT
LD-PCR
AAAAAAAA TTTTTTTT
文库构建: Clontech MM文库构建方法
▪ SMART合成cDNA ▪共转化，涂板
▪ 培养，收集菌液 ▪ 文库分装，冻存
自己 做克隆
▪1ml mating
文库构建: Clontech MM文库构建方法
PL检测
验证互作: FRET分析
632466 pDsRed -Monomer-C1 Vector
632470 pAcGFP1 -C1-Vector
Clontech Matchmaker系统产品选择指南
Clontech Matchmaker系统近期参考文献
1. The FRIGIDA Complex Activates Transcription of FLC, a Strong Flowering Repressor in Arabidopsis, by Recruiting Chromatin Modification Factors
提取质粒
刮取平板上的 菌落，提取质 粒。
转化酵母菌
Mating筛选
将提取的质粒 转化Y187， 获得酵母文库。
将文库与诱饵 培养液混合， 进行Mating。 涂筛选板，挑 取阳性克隆子。
文库筛选: 验证阳性克隆子（PCR确认）
630497 Matchmaker™ Insert Check PCR Mix2
Clontech MM系统的优点
异常 简便
SMART方法与同源重组技术结合构建 文库，聪明的酵母自己做克隆。
抗性 筛选
AbA抗性筛选的添加，有效抑制背景 生长，大大降低假阳性。
设计 巧妙
文库构建于型酵母菌株α型Y187中，方 便后续与a型菌株Y2H Gold进行mating 直接筛选。
Clontech MM系统: 蛋白互作基本流程
酵母双杂交系统 技术介绍
主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech 酵母双杂交系统 • 常见问题分析
背景介绍: 关注蛋白质
蛋白组时代
蛋白质功能
生物信息学 的发展
蛋白质相互 作用研究
背景介绍: 为什么要研究蛋白互作？
发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 筛选药物的作用位点 研究药物对蛋白质之间相互作用的影响 建立基因组蛋白连锁图
Brook, Stony Brook 11794.
63000次引用
基本原理: GAL4转录因子的结构
DNA-BD
AD
BD 结合结构域
GAL4 蛋白具有两个功能结构域
AD 激活结构域
基本原理: GAL4转录因子的分子机理
正常情况在酵母细胞内:
GAL UAS
Promoter
Transcription gal metabolic gene
Matchmaker Chemiluminescent Co-IP Vector Set（630458） Matchmaker Chemiluminescent Co-IP Kit（630459） Prolabel Chemiluminescent Detection Kit （631723）
验证互作: 体外Co-IP验证实验流程
H Nara, T Onoda, M Rahman, A Araki… - Cellular …, 2011 – Elsevier
4. FHL1 interacts with oestrogen receptors and regulates breast cancer cell growth
L Ding, C Niu, Y Zheng, Z Xiong… - Journal of Cellular …, 2011 - Wiley Online Library
T Kiyomitsu, H Murakami… - Molecular and Cellular …, 2011 - Am Soc Microbiol
主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech 酵母双杂交系统 • 常见问题分析
常见问题分析: 酵母双杂交文库如何获得？
基本原理: 酵母双杂交参考文献
• Nature. 1989 Jul 20;340(6230):245-6.
• A novel genetic system to detect protein-protein interactions. • Fields S, Song O. • Department of Microbiology, State University of New York at Stony
▪ SMART合成cDNA ▪共转化，涂板
▪ 培养，收集菌液 ▪ 文库分装，冻存
▪1ml mating
文库构建: Clontech MM自制文库筛选
▪ SMART合成cDNA ▪共转化，涂板
▪ 培养，收集菌液 ▪ 文库分装，冻存
混合
DDO/X/A
▪1ml mating
QDO/X/A
文库筛选: Clontech MM文库筛选
630489 Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System
BD vector：pGBKT7 AD vector: pGADT7
Y187 Y2H Gold
630439 极大提高转化率 可以单独购买
630489
三个载体 阳性对照， 阴性对照。
文库筛选: Clontech MM 系统质粒
如何获得酵母双杂交文库
用630490 自己
构建文库
购买Clontech 公司
预制文库
请Takara公司 提供
文库构建服务
常见问题分析: 一定要做自激活检测吗？
自激活检测必须做：
1.需要在Y2H Gold菌株中进行。 2. 如果出现自激活现象需要调 整AbA浓度或者调整序列。 3. 如果菌落生长过慢，可能是 表达有毒性，需要用低拷贝质 粒pGBT9(630490提供)。
Clontech蛋白互作相关试剂盒
自己构建文库： 630490 预制细菌文库： 638802 （传统型） 预制酵母菌文库： 630480 （均一化，通用型）
酵母双杂交系统： 630489 酵母菌转化试剂盒： 630439 酵母培养基（套装）： 630495 插入片段检测： 630497 酵母质粒提取： 630467
酵母单杂交-蛋白与DNA的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System （630491）
酵母双杂交-蛋白与蛋白的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System（630489） • Make your own “Mate & Plate™”library System (630490)
在GAL4 based双杂交系统中:
GAL4 AD
Reporter Gene
基本原理: 三个启动子，四个报告基因
获得阳性克隆子
报告基因表达
AbA 抗性筛选
X-a-gal 蓝白筛选
Ade 营养筛选
His 营养筛选
M1
G1
G2
主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech酵母双杂交系统 • 常见问题分析
7. Protein Interaction Domain Mapping of Human Kinetochore Protein Blinkin Reveals a Consensus Motif for Binding of Spindle Assembly Checkpoint Proteins Bub1 and BubR1
K Choi, J Kim, HJ Hwang, S Kim… - The Plant Cell …, 2011 - Am Soc Plant Biol
2. Extracellular signal-regulated kinase 8 (Erk8) controls estrogen-related receptor α (ERRα) cellular localization and inhibits its transcriptional activity
M Rossi, D Colecchia, C Iavarone, A Strambi… - Journal of Biological …, 2011 – ASBMB
3. WSB-1, a novel IL-21 receptor binding molecule, enhances the maturation of IL-21 receptor
6. Duplicated C-class MADS-box genes reveal distinct roles in gynostemium development in Cymbidium ensifolium (Orchidaceae)
SY Wang, PF Lee, YI Lee, YY Hsiao… - Plant and Cell …, 2011 - Jpn Soc Plant Physiol
背景介绍: Clontech 酵母双杂交系统的功能
发现新的与已知蛋白互作的蛋白 鉴定两个蛋白之间的相互作用
确定蛋白相互作用的区域
背景介绍: Clontech分子生物学工具
Gene discovery
Gene Function
Gene Expression
Clontech
Matchmaker™
背景介绍: Matchmaker Gold 系统
文库筛选: 均一化通用文库筛选
Normalized Universal Pre. library
均一化通用型文库
高丰度与低丰度均衡 大大降低工作量 大大降低假阳性 更高的基因代表性
混合
DDO/X/A
QDO/X/A
文库筛选: 传统细菌文库筛选
文库培养
取1ml菌液按 照一定比例 用LB稀释， 150ul/板进 行涂板，过 夜培养。
25ul 2×mix
30 PCR cycles 25ul H2O
文库筛选: 酵母质粒提取
630467 Easy yeast Plasmid Isolation Kit
验证互作: 体内验证
630305
Mammalian Matchmaker TwoHybrid Assay Kit 2
SEAP
验证互作: 体外Co-IP验证
5. Rab4 interacts with the human P‐glycoprotein and modulates its surface expression in multidrug resistant K562 cells
C Ferrándiz‐Huertas… - … Journal of Cancer, 2011 - Wiley Online Library
酵母三杂交—三个蛋白之间的相互作用
• pBridge Three-Hybrid Vector （630404）
背景介绍: Matchmaker Gold系统原理
Reporter Gene Reporter Gene Reporter Gene
主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech 酵母双杂交系统 • 常见问题分析
常见问题分析: 诱饵的大小有限制吗？
我们有文献报道的8-750个氨基酸都有成功的案例。
1. Heery, D.M. et al. (1997) Nature 387(6634):733–wk.baidu.com36.
体内验证： 630489 630305 体外Co-IP验证： 630458 630459 631723 631604
文库构建: Clontech MM文库构建方法
▪ SMART合成cDNA
AAAAAAAAA
▪共转化，涂板 ▪ 培养，收集菌液
GGG CCC
AAAAAAAAA TTTTTTTT
▪ 文库分装，冻存 ▪1ml mating
诱饵载体 In Y2H Gold
文库载体 In Y187
文库筛选: 诱饵载体构建及其自激活检测
SD-Trp/X/A
文库筛选: Mating方法筛选
Y187 α型
Mix Mating
二倍体
DDO筛选
QDO筛选
Y2H Gold
a型
Mating 接合反应 酵母的有性生殖过程，
Clontech利用这个过程，实现了文库筛选。