第四章 动物干细胞

二、胚胎干细胞的鉴定方法
• 1. 形态鉴定： • 核质比大，体积小，细胞集落小鼠呈鸟巢状， 牛、猪等呈馒头状，人呈扁平、松散聚合体。 • 2. 核型分析： • 二倍体核型，染色体受损情况等。
• 3. ESC特异性表面抗原表达的鉴定： • 小鼠ESC以SSEA-1为主，人以SSEA-3、 SSEA-4为主。此外，ALP、Otc-4等都可作 为表面标志。 • 4. 端粒酶活性鉴定： • 端粒长度及端粒酶活性检测。 • 5. 体内外分化能力鉴定：体内外分化能力 鉴定：胚胎小体（EB，或称拟胚体）
• 培养基的准备： • 用DMEM（高糖）培养液，其中胎牛血清的 浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸； β -巯基乙醇。 • 常采用添加LIF等抑制ESC的分化潜能；添 加EGF等生长因子来促进ESC的增殖。
LIF抑止胚胎干细胞分化的信号通路
LIF 干细胞表面的LIF受体和gp130蛋白形成异二聚体 激活JAK酪氨酸激酶系统 激活MAP激酶ERK级联反应和STAT3蛋白 STAT3形成同型二聚体入核 激活核内靶基因转录
成為組織工程研究的先驅。
2.组织工程的方法
活体组织细胞分离
与胞外基质分子混合 细胞体外培养扩增形成组织 移植到体内
３.组织工程的三要素
细胞、支架、信号
（1）种子细胞
细胞必须能不断进行细胞分裂，且必须能 被调控分化成特定的组织细胞 干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞(如MSC) 组织来源细胞：自体或异体组织细胞
Culturing Hematopoietic Stem Cell
造血干细胞的体外培养
如造血干细胞的鉴定：
• 细胞形态 ：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小 • 细胞表面标志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1);
L/TAL-1； CD34；GATA-1；
• 基因表达：TAL-1；GATA-2 ；β H1；β 主要珠蛋白 • 体外移植：浆细胞移植给患者能恢复造血功能，并且二 次移植仍可重建造血系统。
造血干细胞的移植
• 移植前处理:
超大剂量的放疗、化疗尽量消灭肿瘤细胞，同时抑制患
者的免疫系统，使供体者的造血干细胞可以顺利植入。 • 采集供体者的造血干细胞（骨髓、外周血、脐带血），并与 受体进行HLA配型； • 将造血干细胞输入到受体者体内，造血干细胞会自动定居到
脊髓。
三、成体干细胞的应用：细胞移植技术
• • • • • • 主要步骤包括： 1. 培养体系的选择和准备 2. 胚胎采集 3. ICM的获取 4. ICM的离散 5. ESC的建系
1. 培养体系的选择和准备
• 饲养层细胞的准备： • 饲养层细胞一方面对ESC细胞帖壁起支持作用， 另一方面其分泌蛋白可抑制ESC分化，维持其增 殖特性和多能性。 • 常用饲养层细胞为成纤维细胞（如STO成纤维细 胞系）、子宫内皮细胞、3T3细胞株等。 • 为了阻断饲养层细胞的分裂，而不影响其分泌蛋 白的产生，通常采用γ射线或丝裂霉素C处理之。
第四章 动物干细胞
• 第一节 干细胞的概念和分类 • 一、概念
干细胞（Stem cell）是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,能产 生表型和基因型与自己完全相同的子细胞，并具有不同分化潜能。
胚胎干细胞
干细胞的主要生理特征：
• 形态特征：圆形或椭圆形，体积小，核质比大； • 生化特征：较高的端粒酶活性；一般都有独特的表 面标志； • 增殖特征: 自稳定性：单细胞或无脊椎动物——不对称分裂 哺乳动物——种群意义上的不对称分裂 • 分化特征：是干细胞最重要的特征。干细胞本生不 是终末分化细胞，具有再分化的潜力。
• • • • • 生物学特征： 1、慢周期性 2、自我更新和再生能力的有限性 3、不对称分裂 4、细胞鉴定标志
造血干细胞
• 造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要 存在于骨髓、外周血、脐带血中。
• 造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗
传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有效方法。 • 与骨髓移植和外周血干细胞移植相比，脐血干细胞 移植的长处在于无来源的限制，对HLA配型要求不 高，不易受病毒或肿瘤的污染。
不同形态结构的组织工程生物材料
天然高分子材料
蛋白质支架 – 胶原 – 明胶 多糖支架 – 海藻酸盐 – 壳聚糖 – 透明质酸 蛋白质－多糖支架
合成聚合物材料
聚丙烯酸及其衍生物 聚乙二醇及其共聚物 聚乙烯醇 聚交酯
聚乳酸（PLA） 聚（D,L-乳酸-co-乙醇酸）（PLGA） 聚乙交酯（PGA）等
Growth factor stimulation
（2）组织生长支架需求：
• • • • • •
符合生物安全性要求 合适的可生物降解吸收性 合适的孔尺寸、高孔隙率和相连的孔形态 特定的三维外形 高表面积和合适的表面理化性质 与植入部位组织力学性能相匹配的结构强度
组织工程支架的来源
支架材料 – 天然高分子材料 – 合成降解聚合物 – 生物陶瓷 – 生物复合材料
鼻咽畸胎瘤
淋巴管瘤
生殖嵴与PGC（原始生殖细胞）
成体干细胞：神经干细胞
• • • • •
二）根据分化潜能分类 全能干细胞：如ESC 多能干细胞：如造血干细胞、间充质干细胞 定向祖细胞：如造血母细胞等。 专能干细胞：皮肤干细胞，成肌细胞等
• • • • • • •
三）根据干细胞存在的组织器官分类 胚胎干细胞 造血干细胞 神经干细胞 肝脏干细胞 皮肤干细胞 肌肉干细胞等
• 4. ICM的离散 • 胰蛋白酶消化即可离散ICM。 • 5. 胚胎干细胞建系
三、胚胎干细胞的应用
研究意义
人胚胎发育机制及影响因素的研究。 用于药物机理及毒性实验的研究，减少人体 和动物的实验及临床研究。 将胚胎干细胞定向分化的细胞用于制造人体 细胞、组织和器官。
第三节、胚胎干细胞的生物学特性 与鉴定方法
四、干细胞技术研究面临的问题
用于干细胞研究的胚胎来源困难;
如何保持干细胞的全能性，并控制向特别类型细胞 转化？
如何分离、纯化干细胞？
分化后的细胞是否有致瘤性？ 干细胞在体外发育成完整的器官尚难以做到; 分化细胞移植仍有可能发生免疫排斥;
伦理问题
作业题
• • • • 1、什么是干细胞？如何分类？ 2、干细胞有什么生物学特性？ 3、简述来源于ICM的胚胎干细胞分离方法。 4、ESC培养时常用的饲养层细胞有哪些？ 其作用是是什么？ • 5、什么是成体干细胞？有哪些种类？
造血干细胞的来源
• 骨髓；1/400
• 外周血；1/100000
• 脐带血；1/10000 • 胎儿造血系统； • 胚胎干细胞和胚胎生殖细胞。
• 二、成体干细胞的分离与鉴定（以HSC为例） • 无菌采集骨髓 低渗处理 密度梯度离 心 获单核细胞 CD34抗体标记
流式细胞仪分离结合免疫吸附分离 鉴定。
ห้องสมุดไป่ตู้
表达相应蛋白抑止ESC的分化
• 2. 胚胎的采集 • 一般囊胚期胚胎或后桑葚胚。 • 3. ICM的获取 • 1）直接分离法：囊胚于饲养层上自行发育成孵化 囊胚，待ICM扩大增殖时挑取。或使用链霉蛋白 酶处理ZP，获得裸胚培养。 • 2）免疫分离法：链霉蛋白酶去除囊胚晚期胚泡 ZP，依次转移至补体灭活和未灭活的抗血清中， 去除滋胚层细胞后，吸取ICM，移至饲养层培养。
A.小鼠成纤维饲养细胞上培养8天后的ICM（标尺＝100um） B.ICM中分离出的H9细胞系（标尺＝100um） C. H9细胞系（标尺＝50um） D.在无小鼠胚胎成纤维细胞，但有LIF（20ng/ml）的条件下培养5d后，H9 细胞发生分化（标尺＝100um）
第四节、成体干细胞
• 一、概念和生物学特征 • 概念： 指一群分布在成体组织中尚未分化的、具 有自我更新、并负有构建和补充某种组织的各种类 型细胞潜能的干细胞。
• 二、分类 • 一）根据发生来源分类 • 胚胎干细胞： 来自早期胚胎（ESC）、原始生殖细胞
（PGC）、或畸胎瘤组织（EC）等
• 成体干细胞：（MSC），神经干细胞（NSC）
如骨髓造血干细胞（HSC），间质干细胞
• ESC
什么是畸胎瘤
• 如果在胚胎不同时期，某些多能细胞从整体 上分离或脱落下来，使细胞基因发生突变， 分化异常，则可发生胚胎异常。 • 一般认为，这种分离或脱落发生于胚胎早 期，则形成畸胎；而如发生于胚胎后期，则 形成了具有内胚层、中胚层和外胚层三个胚 层的异常分化组织，即形成了畸胎瘤。
细胞类型 神经细胞 心肌细胞 产生胰岛素的细胞 软骨细胞 血细胞 肝细胞 皮肤细胞 骨细胞 视网(眼)细胞 骨骼肌细胞 治疗的疾病 中风、帕金森氏病、老年痴呆症、 脊髓损伤、多发性硬化病 心脏病发作、充血性心脏病 糖尿病 骨性关节炎 癌症、免疫缺乏症、遗传学血液 病、白血病 肝炎、肝硬化 烧伤 骨质疏松症 黄斑症 肌肉萎缩症
胚胎干细胞的诱导分化：
胎牛血清，骨髓基质细胞共培养
胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－造血细胞
RA
胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－神经细胞
DMSO
胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－肌肉细胞
TGF-B1, VEGF, bFGF
胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－血管和内皮细胞
RA+胰岛素+T3
胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－脂肪细胞
BMP-2, BMP-4
胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－软骨细胞
地塞米松，磷酸甘油
胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－骨细胞
基因转染
胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－胰岛素分泌细胞
人胚胎干细胞注射至免疫缺陷小鼠的后腿肌肉中形成的各种组织： （a）肠样结构；(b)神经上皮花结；(c）骨骼；(d)软骨 ；(e)横纹肌；(f)肾。
补充知识：组织工程
１.组织工程的概念
应用工程学和生命科学的原理和方法，
研究细胞、组织诱导因子和生物材料间相
互作用的关系，研制生物性替代物用以修 复或重建组织器官的结构，维持、恢复和 改善病损组织或器官的功能。
• 1993年Langer及Vacanti兩位學者在著名的”Science”學術 期刊上提出組織工程(tissue engineering)的構想，隨後根據 此構想將軟骨細胞培養於人耳形狀的生醫材料上，再植入老 鼠背部(上圖)，形成具有耳朵外觀的組織，此一前瞻性技術
第二节 胚胎干细胞
• 通过建立体外培养的方法，获得保持增殖且 不分化的胚胎干细胞系的技术称为胚胎干细 胞的建系。 • 一、胚胎来源的干细胞系（p132 图6-1） • 1. 囊胚阶段的内细胞团（ICM） • 2. 来源于生殖嵴部位的原始生殖细胞（PGC） • 3. 来源于畸胎瘤组织（EC）
二、胚胎干细胞的建系
支架设计及制备技术
生物陶瓷
磷酸钙陶瓷 聚磷酸钙 羟基磷灰石 珊瑚（碳酸钙）
支架设计及制备技术
• 成骨细胞良好地粘附于壳聚糖 - 明胶 / 羟基磷灰石 支架上，生长状态良好，分泌大量细胞外基质。
（3）生长因子
生化特征
• 具有碱性磷酸酶和端粒酶活性；
•
•
表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60等表面标志；
表达OCT-4蛋白；
人胚胎干细胞的表面标志
Otc4基因
• Otc4基因被认为在整个卵子生成和囊胚附 殖前以及早期外胚层中都表达，是受精卵 全能性的关键。 • Otc4基因只能在胚胎中才能得到完全表达， 而在成体动物体细胞中的表达基本上被关 闭。这就意味着克隆人技术的第一步就存 在很大问题。所以Otc4也被称为克隆人终 结者。
• 一、生物学特性 • 增殖与分化特征：
• 永生化(immortal)； • 能维持稳定的正常的二倍体染色体结构； • 有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化； • 能参与胎儿所有组织的发育过程；
形态特征
• • 体积小、核大，有一个或多个核仁； 胚胎干细胞克隆紧密堆积，细胞之间无明显的 界限，细胞克隆有一定形状规律。
三、胚胎干细胞定向诱导分化的方 法
• 改变细胞的培养条件: 改变细胞的培养条件是ES细胞定向分化的基本 策略,常用的方法有:与辅助细胞共培养;在半固体培 养基中原位生长分化;添加生长因子、化学诱导剂等。
• 导入外源性基因,使其分化为某一特定类型的细胞。
• 体内定向分化,使ES 细胞多数分化为该组织特异性 的细胞。