全血分析白细胞-血小板粘附

全血分析白细胞-血小板粘附

当血管受到损伤时,血小板通过迅速形成血栓在止血反应中起重要作用。在炎症和血栓性疾病中，血小板会与循环血中的白细胞粘附，特别是与单核细胞和粒细胞。血小板与单核细胞和粒细胞的粘附是通过血小板脱颗粒活化后表面表达P选择素完成的。P选择素进而与表达在白细胞表面的PSGL-1（P选择素蛋白受体1，也称CD162）结合。随后白细胞-血小板聚集物形成

（Leukocyte-PlateletAggregates LPAs），并且聚集体通过多种机制稳定持续下去，其中包括白细胞Mac-1(CD11b/CD18)与血小板糖蛋白（GP）Ib的结合。

循环血中单核细胞-血小板粘附已被证明是一种较体内血小板表面P选择素表达更为敏感的指标。尽管细胞之间的反应过程是相当复杂的，但用流式细胞仪检测全血中LPAs则相对简单。虽然检测低表达的P选择素相当困难，但低水平的P选择表达便能启动与白细胞的粘附过程。当血小板与白细胞粘附形成后，可通过足够的血小板特异性标记便轻易地将它们检测出来。流式细胞仪通过光散射信号和白细胞特异性试剂，如CD14，设门圈出白细胞并分析LPAs。通过第二个标志来识别血小板，如CD41 (GPIIb), CD61 (GPIIIa),或 CD42a (GPIX)，可区分出高表达CD41,CD61, 和 CD42a 的血小板颗粒。血小板颗粒的大小异质性比较大（直径1至5um），并且血小板形成的微颗粒platelet-derived microparticles (PDMP)也表达P选择素，这就可解释为什么会出现比同型对照荧光稍强的血小板阳性白细胞。这种类型的LPAs不应被忽视，因为循环PDMP经常与临床疾病状态有相关性。

在此推荐阅读6.10章节，因为其中许多重要注意点也同样在循环LPA检测十分重要。比如，抗凝剂的选择与全血样本的处理同样会影响LPAs的分析。可靠的样本处理过程对于检测的敏感度也十分重要，同时体外引起的血小板活化也会引起非特异性的LPAs的数量增加。

基本方案

全血分析白细胞-血小板聚集

单核细胞和粒细胞可通过FS/SS参数识别出来，但使用特异性白细胞抗体可增加识别精度。血小板与血小板的粘附也会影响光散射设门方案，特别是对单核细胞群体的影响。鉴于以上原因，我们推荐在使用抗血小板抗体以外再使用抗白细胞抗体。每个实验室必须自己滴定抗体来选择最佳抗体浓度与孵育时间。CD14是用来识别单核细胞最常用的抗体，尽管这个抗原会因细胞活化而表达降低或在不成熟细胞上呈弱表达。CD45阴性设门可有效去除非白细胞-血小板聚集物，但需注意的是要避免将大颗粒淋巴细胞与嗜细胞混入单核细胞门内。大颗粒淋巴细胞的光散射特征与单核细胞相似，但CD45着色要亮得多。嗜碱粒细胞CD45着色与单核细胞类，但它的光散射特征与淋巴细胞类似。因此，只有联合光散射与白细胞特异性标志物才能对单核细胞进行最佳设门。中性粒细胞因为具有很高的侧向散射光信号，当与白细胞特异性标志物联合设门时遇到的问题较少。前向散射光对于设门淋巴细胞帮助不大，因为当血小板大小不一致，特别是在血小板活化后会干扰淋巴细胞。

血小板GPIIb-IIIa复合物（CD41/CD61）这个标志物经常被用来特异性地识别血小板，因为这个受体在血小板上高度表达（80,000/血小板）。选择抗体监测这个复合物时要多加注意，因为CD41/61是血小板一个重要的受体，它能与很多不同的粘附蛋白受体结合，这将可能影响正常的LPA的形成及其稳定性。还要注意的是CD42b它很容易受到蛋白水解酶的影响并且当血小板活化时CD42a和CD42b

会下调表达。推荐使用PE（藻红蛋白）荧光素作血小板特异抗体的标记物，因为这个荧光亮度很强与粒细胞自发荧光相比时它可显现出来。粒细胞的同型对照（包括粒细胞的自发荧光）会在FITC通道表现得十分强烈，经常会引起LPA直方图阳性区域设置错误。

材料

血小板特异性：抗-CD42a, -CD42b, -CD41, -CD61（这些抗原中一个或几个在一些稀有的遗传性疾病中会缺失，如Bernard-Soulier综合症和Glanzmann血小板功能不全）

白细胞特异性标志物：单抗-CD14，-CD64, -CD33, 或 -CD45（这些抗体通常与血小板特异性抗体混在一起）

阴性对照：使用亚型、荧光素、浓度一致的非特异性抗体来确定荧光背景信号（需与血小板特异性抗体联合使用）

血小板活化剂：可使用ADP或凝血酶受体-活化蛋白

配方修改过的HEPES/Tyrode’s缓冲液

样本来源：人全血（病人或正常人）

固定溶血剂：使用含有甲醛的红细胞裂解液，如FACS溶血剂，BD公司出品。

使用含有柠檬酸钠或其他适当抗凝剂的采血管

21-G(或更大号)的采血针头

装备有488-nm激发光的流式细胞仪及相配套的滤光片用于收集荧光。

注：不同的实验室应自己选用适当的检测条件及样本处理方法。

1，抽血前，在检测管中预先加入20 μl的血小板特异性抗体（或同型对照抗体），20 μl的白细胞特异性抗体，和20 μl的血小板活化剂（或HT缓冲液），每个检测管中共加入60 μl 的试剂。

2.使用21-G（或更大号的）采血针并轻柔压血进行采血，采血后将血直接注入含有柠檬酸或其他适宜抗凝剂的收集管。确保血样平衡、缓慢流入样本管内，并弃用最初采集的2至5ml血液。

3. 血样采集后20分钟内将20 μl血样加入第1步制备的检测管中并轻轻混匀。室温下静置孵育15分钟。如要使用更高浓度的全血则要注意避免血小板聚集，这可能会影响光散射设门。

4.加入800 μl的固定/溶血剂并室温下孵育10分钟左右使得红细胞被裂解。4°C下储存样本。

5.按照以下步骤使用流式细胞仪分析样本：

a.以中速分析样本（见参数解析和故障解决章节）。因为在未经洗涤的样本中存在有高数量的

血小板，当样本以高流速分析时会增加白细胞-血小板的聚集。收集光散射信号时使用线性模式，并将阈值设在前向散射光上。最少收集1000个CD14阳性的单核细胞，它大概占总白细胞的2%-15%。

b.建立一个侧向散射光与CD14（或其他白细胞标志物）荧光的双参数点图（见图1）。

c.建立一个门圈定目标细胞群体（如：单核细胞或粒细胞）。