4-1.链霉菌的分子生物学
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ne library made from genomic DNA are called genomic library cDNA library: gene library made from complementary DNA are known ary）
为了使任意一个DNA片段 的载体）。这个数量的值可以由已知 DNA的计算
ln (1-0.99 ) Nhuman = ln〔1- (2×104/3×109 ) 〕 大小 KB 5 23 45 需要独立克隆数* 多 较少 少
大肠杆菌质粒 λ 噬菌体 cosmid* 指构建大肠杆菌基因所需的独立克隆数基因的特点
比较 存放的内容 检索方式 得到方法 library books gene library gene (重组子） 无目录可查 大量筛选
有目录可以检索 到指定的位置取
研究基因为什么要先克隆基因？
1 基因太微小，无法直接观察到它们，必须借助其它实验
方法。 2 普通的实验手段很难观察到单个基因分子，必须观察 多个同样分子的群体。 3 DNA分子太“大”（链霉菌的基因组DNA大约为8000KB
.授体链霉菌
重组噬菌体 转导 amp , antib＋
重组噬菌体在胞内游离 ( 质粒抗生素抗性, 产生抗生素活性)
R
原生质体
融原裂解 放出噬菌体 (携带抗生素生物合成基因片段) amp , antib－
噬菌体整合在染色体的抗生素生物合成基因簇上 (质粒抗生素抗性, 无抗生素活性)
R
挑选突变克隆菌株的过程
基因克隆 Gene Clone
“克隆”一词最早来源于来源于拉丁语，指的是无性繁殖。 在当今生命科学的各个领域， “克隆”一词被广泛地使 用。它不仅在词义上有名词和动词之分，而且在不同的学 科之间和不同的的研究层次上也有不同的含义。
在多细胞的高等个体水平上，例如植物与动物，人
们用克隆表示由具有相同基因型的同一物种 的两个 或多个个体组成的群体。例如，从同一受精卵分 裂而来的单卵双生子（monozygotic twins)便是属于 同一克隆。
在细胞水平上，涉及胚胎学，免疫学及细胞生物学等学
科，克隆一词是指由同一祖细胞（progenitor cell)分裂而来
的一群遗传上同一的子细胞群体。 在分子水平上，诸如分子生物学和分子遗传学学科，凡 带有一段DNA插入序列的，独立的寄主/载体单元（例如， 大肠杆菌寄生细胞中的重组质粒载体）也称为克隆。
P：克隆到目的基因的概率 f：插入片段长度(bp)与基因组DN 4.6×10 6 bp
如果重组子中连接大肠杆菌DNA片段的平均长度为2×104 bp, 则以99%的概率克隆到任一基因所需的独立克隆(重组
子)数量为：
ln (1-0.99 ) NE.coli = ln〔 1- (2×104/4.6×106 ) 〕 = 1.1×103
抗生链霉菌 质粒载体 pIJ702
提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形质粒 DNA 片段 5’ 脱 磷酸 酶切
连接酶连接
受体菌 S.Lividans 重组质粒
·
·
·
转化原生质体 原生质体
·
筛选的目标：挑选呈紫红色的菌落 原理：吩恶嗪酮合成酶在受体菌 S.Lividans 中表达后使菌落呈紫红色。
我们通常所说的基因克隆，实质上包含着待研究的目 的基因的分离和鉴定两个主要内容。而整个基因克隆 的过程则包括如下四个基本步骤。
基因克隆的四个基本步骤
1 用于基因克隆的DNA材料的选择，及DNA分子的片段化。
2 外源DNA片段与载体分子的体外连接。
3 将人工重组的DNA分子导入到它们能够正常复制的寄主
重组质粒 转化 原生质体
筛选 30，000 多菌落，从中找到一株具 有抗菌活性的转化子 PE15-1。
PE15-1
发酵 产物分析（HPLC）
提取质粒
.
（二）. 克隆抗生素生物合成基因簇的策略
1. 克隆到标准宿主 （如变青 链霉菌） 然后检测单个基 因产物 2．产生菌阻断变株的互补 杀假丝菌素（对-氨基苯甲酸合 成酶） 放线菌素（苯氧连氮合成酶） 放线紫红素 克拉维酸 链霉素 3． 抗生素生产菌株突变克隆 4．先克隆抗性基因，然后再 探测与其连锁的其它基因 次甲霉素 土霉素 红霉素 嘌呤霉素 素产生菌中 7． 利用一种已克隆的基因片 段，探测其它菌基因库 中的同源基因 头霉素（Cephamycin） 次甲霉素 榴霉素 泰洛星（Tylosin） 抗生链霉菌 IMRU 3720 天蓝色链霉菌 A3（2） 棒状链霉菌 A TCC27064 灰色链霉菌 A TCC10137 天蓝色链霉菌 A3（2） 龟裂链霉菌 红色链霉菌 NRRL2338 白黑链霉菌 A TCC12461 弗氏链霉菌 （S.fradiae） S.Cattleya NRRL8057 天蓝色链霉菌 A3（2） 紫红链霉菌 （S.violaceoruber TU22） 灰色链霉菌 IMRU 5370
2.克拉维酸生物合成基因: 棒状链霉菌S.clavuligerus
3.Tetracenomycin 生物合成基因
十一烷基灵菌红素生物合成阻断变株的互补
天蓝色链霉菌 质粒载体 pIJ702 提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形质粒 DNA 片段 连接酶连接 天蓝色链霉菌 十一烷基灵菌红素 生物合成阻断变株 重组质粒 重组质粒 · 5’ 脱 磷酸 酶切
. 8．筛选产物超表达变株，以
十一烷基灵菌红素
天蓝色链霉菌 A3（2）
克隆正调节基因
.
（1）克隆到标准宿主然后检测单个基因产物
例1. J.A.Gil and Hodwood, Gene (1983), 25:119-132 杀假丝菌素(Candicidin)
对-氨基苯甲酸合成酶
灰色链霉菌(S.griseus IMRU 3570) 生物合成途径: 莽草酸 酸 克隆的策略: 杀假丝菌素 分支酸
转化
原生质体
点种
保湿培养
生物活性检测
（3）抗生素生物合成基因的突变克 隆(mutational cloning)
链霉菌 (产生抗生素) 噬菌体载体
提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形噬菌体载体 DNA 片段 菌体 .
突变克隆(mutational cloning )的过程
十一烷基灵菌红素生物合成阻断变株的互补
天蓝色链霉菌 S.coelicolorA(3)2 目的: 克隆十一烷基灵菌红素生物合成基因 策略: 以十一烷基灵菌红素生物合成阻断变株作为受体菌 目标: 筛选抗生素生物合成能力恢复的变株 十一烷基灵菌红素
用本策略克隆到的抗生素生物合成基因簇还有： 1. 链霉素生物合成基因 : 灰色链霉菌S.griseus
(一）. 克隆抗生素生物合成基因的一般过程
. 供体菌(链霉菌) 载体 (含有适当质粒的链霉菌) 受体链霉菌
培养菌丝体
培养菌丝体 培养菌丝体
分离和纯化染色 体 DNA
分离载体 DNA (质粒) 制备原生质体 酶切
酶切 5’脱磷酸 ( CIAP/BAP) DNA 片段大小 的分离
DNA 连接酶连接
转化原生质体
合成途径:
2分子 4-甲基-3-羟基邻氨基笨甲酸
吩恶嗪酮合成酶 发色团 actinocino
放线菌素 克隆的策略: 目标: 首先克隆吩恶嗪酮合成酶基因 策略: 吩恶嗪酮合成酶基因在链霉菌菌S.Lividans中表达后, 发色团使转化子的菌 落呈现紫红色, 因而可以用肉眼识别出阳性菌落.
吩恶嗪酮合成酶基因的克隆
（2）生物合成阻断变株的互补
某种代谢产物产生菌经过诱变剂的作用后,丧失了合成 这种代谢产物的能力, 这样的菌株称为 “生物合成阻断变株”。 以这样的阻断变株作为受体菌, 制备成原生质体, 将连接酶连
接后的重组质粒转化该原生质体, 如果得到某个转化子恢复
了代谢产物(如抗生素)的生物合成, 则表明克隆到了该代谢 产物(如抗生素)的生物合成基因。
（5）列设计DNA中
的核苷酸序列, 并合成一段该序列的放射性探针, 利用菌
落杂交技术, 克隆阳性菌落。 .
.
GGATCCAGCATGCAGG
转导子
保湿培养
点种
阳性突变克隆 生物活性测定
（4）先克隆抗性基因，然后 寻找与其连锁的其它基因
. 链霉菌 (产生抗生素) 质粒载体 提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 DNA 片段 连接酶连接 变青链霉菌（或阻 断变株） 重组质粒 转导 线形质粒 5’ 脱 磷酸 酶切
原生质体
筛选条件： 在平板上加入相应的抗生 素，挑选抗性菌株既是阳性克隆菌株 .
再生 (筛选带重组质粒的转化子)
目的克隆菌株的筛选 .
如何识别重组子（菌落）
. 畜厩链霉菌 (产生头孢菌素 C) S.cattley NRRL8057 质粒载体 pIJ943 提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形质粒 20～40 kb DNA 片段 连接酶连接 变青链霉菌 1326 5’ 脱 磷酸 酶切
对-氨基苯甲
目标: 首先克隆对氨基苯甲酸合成酶基因
策略: 用变青链霉菌对氨基苯甲酸合成酶缺陷型变株 S.Lividans (Pab—) 作为克隆的宿主。
例1. 对氨基苯甲酸合成酶基因的克隆
灰色链霉菌(S.griseus IMRU 3570)
链霉菌 质粒载体
提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 DNA 片段
，无法对整个基因组进行操作，必须将整个基因组DNA
分成很小的片段（小于40KB）才便于研究。 4 通常的载体只能携带小于40KB的外源DNA片段。
基因组DNA（Genom蛋白酶对微生物细胞进行消化， 采用酚和氯仿提取的方法除去蛋白。 得到纯度较高的基因组DNA后，再用限制性 内切酶将其切成适合与载体连接的长度，有时需 要用多种内切酶结合使用来制备DNA片段。
细胞内。 4 获得重组体分子的转化子。
如何克隆到目的基因
链霉菌染色体的大小约为 8000KB 大多数基因的大小为 1 KB，通过普通质粒克隆到的DNA片段 大多数为5 —— 20KB.
如何确保克隆到任何一个目的基因？
答案：需要数量足够多的独立克隆。 由于单个基因仅占染色体DNA分子总量极其微小的比例， 为了使拟克隆的基因不被遗漏，需要许多不同的独立克隆。 独立克隆：每个克隆带有的DNA片段都不相同。
酶切 线形质粒 5’ 脱 磷酸
连接酶连接 受 体 菌 (对 氨 基苯 甲酸合成酶缺陷型 变株) — S.Lividans (Pab )
重组质粒 转化原生质体
原生质体
筛选的条件：基本培养基 原理：若转化子不含有对氨基苯甲酸合成酶基因，则不能在基本培养基上生长。
例2. 放线菌素生物合成基因的克隆
G.H.Jones and D.A.Hopwood , J.Bio.chem,1984,259:14151-57 抗生链霉菌( S.antibioticus) 放线菌素
3. 链霉菌的分子生物学及其研究方法
链霉菌分子生物学的研究是在基因水平阐明次级代谢 产物生物合成与基因和酶的相互关系。是从本质上认识抗 生素等次级代谢产物生物合成过程的科学。 为了从基因的水平上研究抗生素等次级代谢的生物合 成过程，首先需要克隆抗生素生物合成基因。
主要内容
(一). 克隆抗生素生物合成基因的一般过程 (二). 克隆抗生素生物合成基因簇的策略和方法 (三). 抗生素生物合成基因精细结构的研究 (四). 基因生物功能的研究
为了使任意一个DNA片段 的载体）。这个数量的值可以由已知 DNA的计算
ln (1-0.99 ) Nhuman = ln〔1- (2×104/3×109 ) 〕 大小 KB 5 23 45 需要独立克隆数* 多 较少 少
大肠杆菌质粒 λ 噬菌体 cosmid* 指构建大肠杆菌基因所需的独立克隆数基因的特点
比较 存放的内容 检索方式 得到方法 library books gene library gene (重组子） 无目录可查 大量筛选
有目录可以检索 到指定的位置取
研究基因为什么要先克隆基因？
1 基因太微小，无法直接观察到它们，必须借助其它实验
方法。 2 普通的实验手段很难观察到单个基因分子，必须观察 多个同样分子的群体。 3 DNA分子太“大”（链霉菌的基因组DNA大约为8000KB
.授体链霉菌
重组噬菌体 转导 amp , antib＋
重组噬菌体在胞内游离 ( 质粒抗生素抗性, 产生抗生素活性)
R
原生质体
融原裂解 放出噬菌体 (携带抗生素生物合成基因片段) amp , antib－
噬菌体整合在染色体的抗生素生物合成基因簇上 (质粒抗生素抗性, 无抗生素活性)
R
挑选突变克隆菌株的过程
基因克隆 Gene Clone
“克隆”一词最早来源于来源于拉丁语，指的是无性繁殖。 在当今生命科学的各个领域， “克隆”一词被广泛地使 用。它不仅在词义上有名词和动词之分，而且在不同的学 科之间和不同的的研究层次上也有不同的含义。
在多细胞的高等个体水平上，例如植物与动物，人
们用克隆表示由具有相同基因型的同一物种 的两个 或多个个体组成的群体。例如，从同一受精卵分 裂而来的单卵双生子（monozygotic twins)便是属于 同一克隆。
在细胞水平上，涉及胚胎学，免疫学及细胞生物学等学
科，克隆一词是指由同一祖细胞（progenitor cell)分裂而来
的一群遗传上同一的子细胞群体。 在分子水平上，诸如分子生物学和分子遗传学学科，凡 带有一段DNA插入序列的，独立的寄主/载体单元（例如， 大肠杆菌寄生细胞中的重组质粒载体）也称为克隆。
P：克隆到目的基因的概率 f：插入片段长度(bp)与基因组DN 4.6×10 6 bp
如果重组子中连接大肠杆菌DNA片段的平均长度为2×104 bp, 则以99%的概率克隆到任一基因所需的独立克隆(重组
子)数量为：
ln (1-0.99 ) NE.coli = ln〔 1- (2×104/4.6×106 ) 〕 = 1.1×103
抗生链霉菌 质粒载体 pIJ702
提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形质粒 DNA 片段 5’ 脱 磷酸 酶切
连接酶连接
受体菌 S.Lividans 重组质粒
·
·
·
转化原生质体 原生质体
·
筛选的目标：挑选呈紫红色的菌落 原理：吩恶嗪酮合成酶在受体菌 S.Lividans 中表达后使菌落呈紫红色。
我们通常所说的基因克隆，实质上包含着待研究的目 的基因的分离和鉴定两个主要内容。而整个基因克隆 的过程则包括如下四个基本步骤。
基因克隆的四个基本步骤
1 用于基因克隆的DNA材料的选择，及DNA分子的片段化。
2 外源DNA片段与载体分子的体外连接。
3 将人工重组的DNA分子导入到它们能够正常复制的寄主
重组质粒 转化 原生质体
筛选 30，000 多菌落，从中找到一株具 有抗菌活性的转化子 PE15-1。
PE15-1
发酵 产物分析（HPLC）
提取质粒
.
（二）. 克隆抗生素生物合成基因簇的策略
1. 克隆到标准宿主 （如变青 链霉菌） 然后检测单个基 因产物 2．产生菌阻断变株的互补 杀假丝菌素（对-氨基苯甲酸合 成酶） 放线菌素（苯氧连氮合成酶） 放线紫红素 克拉维酸 链霉素 3． 抗生素生产菌株突变克隆 4．先克隆抗性基因，然后再 探测与其连锁的其它基因 次甲霉素 土霉素 红霉素 嘌呤霉素 素产生菌中 7． 利用一种已克隆的基因片 段，探测其它菌基因库 中的同源基因 头霉素（Cephamycin） 次甲霉素 榴霉素 泰洛星（Tylosin） 抗生链霉菌 IMRU 3720 天蓝色链霉菌 A3（2） 棒状链霉菌 A TCC27064 灰色链霉菌 A TCC10137 天蓝色链霉菌 A3（2） 龟裂链霉菌 红色链霉菌 NRRL2338 白黑链霉菌 A TCC12461 弗氏链霉菌 （S.fradiae） S.Cattleya NRRL8057 天蓝色链霉菌 A3（2） 紫红链霉菌 （S.violaceoruber TU22） 灰色链霉菌 IMRU 5370
2.克拉维酸生物合成基因: 棒状链霉菌S.clavuligerus
3.Tetracenomycin 生物合成基因
十一烷基灵菌红素生物合成阻断变株的互补
天蓝色链霉菌 质粒载体 pIJ702 提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形质粒 DNA 片段 连接酶连接 天蓝色链霉菌 十一烷基灵菌红素 生物合成阻断变株 重组质粒 重组质粒 · 5’ 脱 磷酸 酶切
. 8．筛选产物超表达变株，以
十一烷基灵菌红素
天蓝色链霉菌 A3（2）
克隆正调节基因
.
（1）克隆到标准宿主然后检测单个基因产物
例1. J.A.Gil and Hodwood, Gene (1983), 25:119-132 杀假丝菌素(Candicidin)
对-氨基苯甲酸合成酶
灰色链霉菌(S.griseus IMRU 3570) 生物合成途径: 莽草酸 酸 克隆的策略: 杀假丝菌素 分支酸
转化
原生质体
点种
保湿培养
生物活性检测
（3）抗生素生物合成基因的突变克 隆(mutational cloning)
链霉菌 (产生抗生素) 噬菌体载体
提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形噬菌体载体 DNA 片段 菌体 .
突变克隆(mutational cloning )的过程
十一烷基灵菌红素生物合成阻断变株的互补
天蓝色链霉菌 S.coelicolorA(3)2 目的: 克隆十一烷基灵菌红素生物合成基因 策略: 以十一烷基灵菌红素生物合成阻断变株作为受体菌 目标: 筛选抗生素生物合成能力恢复的变株 十一烷基灵菌红素
用本策略克隆到的抗生素生物合成基因簇还有： 1. 链霉素生物合成基因 : 灰色链霉菌S.griseus
(一）. 克隆抗生素生物合成基因的一般过程
. 供体菌(链霉菌) 载体 (含有适当质粒的链霉菌) 受体链霉菌
培养菌丝体
培养菌丝体 培养菌丝体
分离和纯化染色 体 DNA
分离载体 DNA (质粒) 制备原生质体 酶切
酶切 5’脱磷酸 ( CIAP/BAP) DNA 片段大小 的分离
DNA 连接酶连接
转化原生质体
合成途径:
2分子 4-甲基-3-羟基邻氨基笨甲酸
吩恶嗪酮合成酶 发色团 actinocino
放线菌素 克隆的策略: 目标: 首先克隆吩恶嗪酮合成酶基因 策略: 吩恶嗪酮合成酶基因在链霉菌菌S.Lividans中表达后, 发色团使转化子的菌 落呈现紫红色, 因而可以用肉眼识别出阳性菌落.
吩恶嗪酮合成酶基因的克隆
（2）生物合成阻断变株的互补
某种代谢产物产生菌经过诱变剂的作用后,丧失了合成 这种代谢产物的能力, 这样的菌株称为 “生物合成阻断变株”。 以这样的阻断变株作为受体菌, 制备成原生质体, 将连接酶连
接后的重组质粒转化该原生质体, 如果得到某个转化子恢复
了代谢产物(如抗生素)的生物合成, 则表明克隆到了该代谢 产物(如抗生素)的生物合成基因。
（5）列设计DNA中
的核苷酸序列, 并合成一段该序列的放射性探针, 利用菌
落杂交技术, 克隆阳性菌落。 .
.
GGATCCAGCATGCAGG
转导子
保湿培养
点种
阳性突变克隆 生物活性测定
（4）先克隆抗性基因，然后 寻找与其连锁的其它基因
. 链霉菌 (产生抗生素) 质粒载体 提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 DNA 片段 连接酶连接 变青链霉菌（或阻 断变株） 重组质粒 转导 线形质粒 5’ 脱 磷酸 酶切
原生质体
筛选条件： 在平板上加入相应的抗生 素，挑选抗性菌株既是阳性克隆菌株 .
再生 (筛选带重组质粒的转化子)
目的克隆菌株的筛选 .
如何识别重组子（菌落）
. 畜厩链霉菌 (产生头孢菌素 C) S.cattley NRRL8057 质粒载体 pIJ943 提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形质粒 20～40 kb DNA 片段 连接酶连接 变青链霉菌 1326 5’ 脱 磷酸 酶切
对-氨基苯甲
目标: 首先克隆对氨基苯甲酸合成酶基因
策略: 用变青链霉菌对氨基苯甲酸合成酶缺陷型变株 S.Lividans (Pab—) 作为克隆的宿主。
例1. 对氨基苯甲酸合成酶基因的克隆
灰色链霉菌(S.griseus IMRU 3570)
链霉菌 质粒载体
提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 DNA 片段
，无法对整个基因组进行操作，必须将整个基因组DNA
分成很小的片段（小于40KB）才便于研究。 4 通常的载体只能携带小于40KB的外源DNA片段。
基因组DNA（Genom蛋白酶对微生物细胞进行消化， 采用酚和氯仿提取的方法除去蛋白。 得到纯度较高的基因组DNA后，再用限制性 内切酶将其切成适合与载体连接的长度，有时需 要用多种内切酶结合使用来制备DNA片段。
细胞内。 4 获得重组体分子的转化子。
如何克隆到目的基因
链霉菌染色体的大小约为 8000KB 大多数基因的大小为 1 KB，通过普通质粒克隆到的DNA片段 大多数为5 —— 20KB.
如何确保克隆到任何一个目的基因？
答案：需要数量足够多的独立克隆。 由于单个基因仅占染色体DNA分子总量极其微小的比例， 为了使拟克隆的基因不被遗漏，需要许多不同的独立克隆。 独立克隆：每个克隆带有的DNA片段都不相同。
酶切 线形质粒 5’ 脱 磷酸
连接酶连接 受 体 菌 (对 氨 基苯 甲酸合成酶缺陷型 变株) — S.Lividans (Pab )
重组质粒 转化原生质体
原生质体
筛选的条件：基本培养基 原理：若转化子不含有对氨基苯甲酸合成酶基因，则不能在基本培养基上生长。
例2. 放线菌素生物合成基因的克隆
G.H.Jones and D.A.Hopwood , J.Bio.chem,1984,259:14151-57 抗生链霉菌( S.antibioticus) 放线菌素
3. 链霉菌的分子生物学及其研究方法
链霉菌分子生物学的研究是在基因水平阐明次级代谢 产物生物合成与基因和酶的相互关系。是从本质上认识抗 生素等次级代谢产物生物合成过程的科学。 为了从基因的水平上研究抗生素等次级代谢的生物合 成过程，首先需要克隆抗生素生物合成基因。
主要内容
(一). 克隆抗生素生物合成基因的一般过程 (二). 克隆抗生素生物合成基因簇的策略和方法 (三). 抗生素生物合成基因精细结构的研究 (四). 基因生物功能的研究