4-1.链霉菌的分子生物学
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转导子
保湿培养
点种
阳性突变克隆 生物活性测定
（4）先克隆抗性基因，然后 寻找与其连锁的其它基因
. 链霉菌 (产生抗生素) 质粒载体 提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 DNA 片段 连接酶连接 变青链霉菌（或阻 断变株） 重组质粒 转导 线形质粒 5’ 脱 磷酸 酶切
原生质体
筛选条件： 在平板上加入相应的抗生 素，挑选抗性菌株既是阳性克隆菌株 .
.授体链霉菌
重组噬菌体 转导 amp , antib＋
重组噬菌体在胞内游离 ( 质粒抗生素抗性, 产生抗生素活性)
R
原生质体
融原裂解 放出噬菌体 (携带抗生素生物合成基因片段) amp , antib－
噬菌体整合在染色体的抗生素生物合成基因簇上 (质粒抗生素抗性, 无抗生素活性)
R
挑选突变克隆菌株的过程
抗生链霉菌 质粒载体 pIJ702
提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形质粒 DNA 片段 5’ 脱 磷酸 酶切
连接酶连接
受体菌 S.Lividans 重组质粒
·
·
·
转化原生质体 原生质体
·
筛选的目标：挑选呈紫红色的菌落 原理：吩恶嗪酮合成酶在受体菌 S.Lividans 中表达后使菌落呈紫红色。
2.克拉维酸生物合成基因: 棒状链霉菌S.clavuligerus
3.Tetracenomycin 生物合成基因
十一烷基灵菌红素生物合成阻断变株的互补
天蓝色链霉菌 质粒载体 pIJ702 提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形质粒 DNA 片段 连接酶连接 天蓝色链霉菌 十一烷基灵菌红素 生物合成阻断变株 重组质粒 重组质粒 · 5’ 脱 磷酸 酶切
. 8．筛选产物超表达变株，以
十一烷基灵菌红素
天蓝色链霉菌 A3（2）
克隆正调节基因
.
（1）克隆到标准宿主然后检测单个基因产物
例1. J.A.Gil and Hodwood, Gene (1983), 25:119-132 杀假丝菌素(Candicidin)
对-氨基苯甲酸合成酶
灰色链霉菌(S.griseus IMRU 3570) 生物合成途径: 莽草酸 酸 克隆的策略: 杀假丝菌素 分支酸
，无法对整个基因组进行操作，必须将整个基因组DNA
分成很小的片段（小于40KB）才便于研究。 4 通常的载体只能携带小于40KB的外源DNA片段。
基因组DNA（Genomic DNA)的制备
为了构建基因文库，需要对基因组DNA进 行提取，包括采用蛋白酶对微生物细胞进行消化， 采用酚和氯仿提取的方法除去蛋白。 得到纯度较高的基因组DNA后，再用限制性 内切酶将其切成适合与载体连接的长度，有时需 要用多种内切酶结合使用来制备DNA片段。
3. 链霉菌的分子生物学及其研究方法
链霉菌分子生物学的研究是在基因水平阐明次级代谢 产物生物合成与基因和酶的相互关系。是从本质上认识抗 生素等次级代谢产物生物合成过程的科学。 为了从基因的水平上研究抗生素等次级代谢的生物合 成过程，首先需要克隆抗生素生物合成基因。
主要内容
(一). 克隆抗生素生物合成基因的一般过程 (二). 克隆抗生素生物合成基因簇的策略和方法 (三). 抗生素生物合成基因精细结构的研究 (四). 基因生物功能的研究
基因文库的大小（Size of
library）
Fra Baidu bibliotek
为了使任意一个基因能够以较高的概 率被克隆到，一个基因文库必需包含足够 数量的重组子（带有目的菌株DNA片段 的载体）。这个数量的值可以由已知 DNA片段的平均长度计算得到。
计算基因文库大小的公式
ln (1-p) N= ln (1- f )
N：基因文库需要的重组子数量
（5） 人工合成寡核苷酸探针探测相应菌体的基因文库
根据代谢产物生物合成酶的氨基酸序列设计DNA中
的核苷酸序列, 并合成一段该序列的放射性探针, 利用菌
落杂交技术, 克隆阳性菌落。 .
.
GGATCCAGCATGCAGG
基因文库（gene library)
许许多多独立克隆的集合体我们把它叫做基因文库。 Genomic library:gene library made from genomic DNA are called genomic library cDNA library: gene library made from complementary DNA are known as cDNA library
细胞内。 4 获得重组体分子的转化子。
如何克隆到目的基因
链霉菌染色体的大小约为 8000KB 大多数基因的大小为 1 KB，通过普通质粒克隆到的DNA片段 大多数为5 —— 20KB.
如何确保克隆到任何一个目的基因？
答案：需要数量足够多的独立克隆。 由于单个基因仅占染色体DNA分子总量极其微小的比例， 为了使拟克隆的基因不被遗漏，需要许多不同的独立克隆。 独立克隆：每个克隆带有的DNA片段都不相同。
人类基因文库大小的计算
ln (1-0.99 ) Nhuman = ln〔1- (2×104/3×109 ) 〕 = 6.9×105
不同载体对基因文库大小的影响
载体类别 插入片段平均大小 KB 5 23 45 需要独立克隆数* 多 较少 少
大肠杆菌质粒 λ 噬菌体 cosmid
* 指构建大肠杆菌基因文库所需的独立克隆数
再生 (筛选带重组质粒的转化子)
目的克隆菌株的筛选 .
如何识别重组子（菌落）
. 畜厩链霉菌 (产生头孢菌素 C) S.cattley NRRL8057 质粒载体 pIJ943 提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形质粒 20～40 kb DNA 片段 连接酶连接 变青链霉菌 1326 5’ 脱 磷酸 酶切
P：克隆到目的基因的概率 f：插入片段长度(bp)与基因组DNA长度的比值(bp)
大肠杆菌基因文库大小的计算
大肠杆菌基因组的大小为 4.6×10 6 bp
如果重组子中连接大肠杆菌DNA片段的平均长度为2×104 bp, 则以99%的概率克隆到任一基因所需的独立克隆(重组
子)数量为：
ln (1-0.99 ) NE.coli = ln〔 1- (2×104/4.6×106 ) 〕 = 1.1×103
合成途径:
2分子 4-甲基-3-羟基邻氨基笨甲酸
吩恶嗪酮合成酶 发色团 actinocino
放线菌素 克隆的策略: 目标: 首先克隆吩恶嗪酮合成酶基因 策略: 吩恶嗪酮合成酶基因在链霉菌菌S.Lividans中表达后, 发色团使转化子的菌 落呈现紫红色, 因而可以用肉眼识别出阳性菌落.
吩恶嗪酮合成酶基因的克隆
(一）. 克隆抗生素生物合成基因的一般过程
. 供体菌(链霉菌) 载体 (含有适当质粒的链霉菌) 受体链霉菌
培养菌丝体
培养菌丝体 培养菌丝体
分离和纯化染色 体 DNA
分离载体 DNA (质粒) 制备原生质体 酶切
酶切 5’脱磷酸 ( CIAP/BAP) DNA 片段大小 的分离
DNA 连接酶连接
转化原生质体
酶切 线形质粒 5’ 脱 磷酸
连接酶连接 受 体 菌 (对 氨 基苯 甲酸合成酶缺陷型 变株) — S.Lividans (Pab )
重组质粒 转化原生质体
原生质体
筛选的条件：基本培养基 原理：若转化子不含有对氨基苯甲酸合成酶基因，则不能在基本培养基上生长。
例2. 放线菌素生物合成基因的克隆
G.H.Jones and D.A.Hopwood , J.Bio.chem,1984,259:14151-57 抗生链霉菌( S.antibioticus) 放线菌素
在细胞水平上，涉及胚胎学，免疫学及细胞生物学等学
科，克隆一词是指由同一祖细胞（progenitor cell)分裂而来
的一群遗传上同一的子细胞群体。 在分子水平上，诸如分子生物学和分子遗传学学科，凡 带有一段DNA插入序列的，独立的寄主/载体单元（例如， 大肠杆菌寄生细胞中的重组质粒载体）也称为克隆。
对-氨基苯甲
目标: 首先克隆对氨基苯甲酸合成酶基因
策略: 用变青链霉菌对氨基苯甲酸合成酶缺陷型变株 S.Lividans (Pab—) 作为克隆的宿主。
例1. 对氨基苯甲酸合成酶基因的克隆
灰色链霉菌(S.griseus IMRU 3570)
链霉菌 质粒载体
提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 DNA 片段
我们通常所说的基因克隆，实质上包含着待研究的目 的基因的分离和鉴定两个主要内容。而整个基因克隆 的过程则包括如下四个基本步骤。
基因克隆的四个基本步骤
1 用于基因克隆的DNA材料的选择，及DNA分子的片段化。
2 外源DNA片段与载体分子的体外连接。
3 将人工重组的DNA分子导入到它们能够正常复制的寄主
十一烷基灵菌红素生物合成阻断变株的互补
天蓝色链霉菌 S.coelicolorA(3)2 目的: 克隆十一烷基灵菌红素生物合成基因 策略: 以十一烷基灵菌红素生物合成阻断变株作为受体菌 目标: 筛选抗生素生物合成能力恢复的变株 十一烷基灵菌红素
用本策略克隆到的抗生素生物合成基因簇还有： 1. 链霉素生物合成基因 : 灰色链霉菌S.griseus
基因克隆 Gene Clone
“克隆”一词最早来源于来源于拉丁语，指的是无性繁殖。 在当今生命科学的各个领域， “克隆”一词被广泛地使 用。它不仅在词义上有名词和动词之分，而且在不同的学 科之间和不同的的研究层次上也有不同的含义。
在多细胞的高等个体水平上，例如植物与动物，人
们用克隆表示由具有相同基因型的同一物种 的两个 或多个个体组成的群体。例如，从同一受精卵分 裂而来的单卵双生子（monozygotic twins)便是属于 同一克隆。
（2）生物合成阻断变株的互补
某种代谢产物产生菌经过诱变剂的作用后,丧失了合成 这种代谢产物的能力, 这样的菌株称为 “生物合成阻断变株”。 以这样的阻断变株作为受体菌, 制备成原生质体, 将连接酶连
接后的重组质粒转化该原生质体, 如果得到某个转化子恢复
了代谢产物(如抗生素)的生物合成, 则表明克隆到了该代谢 产物(如抗生素)的生物合成基因。
重组质粒 转化 原生质体
筛选 30，000 多菌落，从中找到一株具 有抗菌活性的转化子 PE15-1。
PE15-1
发酵 产物分析（HPLC）
提取质粒
.
（二）. 克隆抗生素生物合成基因簇的策略
1. 克隆到标准宿主 （如变青 链霉菌） 然后检测单个基 因产物 2．产生菌阻断变株的互补 杀假丝菌素（对-氨基苯甲酸合 成酶） 放线菌素（苯氧连氮合成酶） 放线紫红素 克拉维酸 链霉素 3． 抗生素生产菌株突变克隆 4．先克隆抗性基因，然后再 探测与其连锁的其它基因 次甲霉素 土霉素 红霉素 嘌呤霉素 5． 用人工合成的寡核苷酸探 针探测基因文库 6． 克隆整个生物合成基因簇 到非抗生素产生菌中 7． 利用一种已克隆的基因片 段，探测其它菌基因库 中的同源基因 头霉素（Cephamycin） 次甲霉素 榴霉素 泰洛星（Tylosin） 抗生链霉菌 IMRU 3720 天蓝色链霉菌 A3（2） 棒状链霉菌 A TCC27064 灰色链霉菌 A TCC10137 天蓝色链霉菌 A3（2） 龟裂链霉菌 红色链霉菌 NRRL2338 白黑链霉菌 A TCC12461 弗氏链霉菌 （S.fradiae） S.Cattleya NRRL8057 天蓝色链霉菌 A3（2） 紫红链霉菌 （S.violaceoruber TU22） 灰色链霉菌 IMRU 5370
转化
原生质体
点种
保湿培养
生物活性检测
（3）抗生素生物合成基因的突变克 隆(mutational cloning)
链霉菌 (产生抗生素) 噬菌体载体
提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形噬菌体载体 DNA 片段 连接酶连接 5’ 脱 磷酸 酶切
重组噬菌体 .
突变克隆(mutational cloning )的过程
基因文库的特点
比较 存放的内容 检索方式 得到方法 library books gene library gene (重组子） 无目录可查 大量筛选
有目录可以检索 到指定的位置取
研究基因为什么要先克隆基因？
1 基因太微小，无法直接观察到它们，必须借助其它实验
方法。 2 普通的实验手段很难观察到单个基因分子，必须观察 多个同样分子的群体。 3 DNA分子太“大”（链霉菌的基因组DNA大约为8000KB
保湿培养
点种
阳性突变克隆 生物活性测定
（4）先克隆抗性基因，然后 寻找与其连锁的其它基因
. 链霉菌 (产生抗生素) 质粒载体 提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 DNA 片段 连接酶连接 变青链霉菌（或阻 断变株） 重组质粒 转导 线形质粒 5’ 脱 磷酸 酶切
原生质体
筛选条件： 在平板上加入相应的抗生 素，挑选抗性菌株既是阳性克隆菌株 .
.授体链霉菌
重组噬菌体 转导 amp , antib＋
重组噬菌体在胞内游离 ( 质粒抗生素抗性, 产生抗生素活性)
R
原生质体
融原裂解 放出噬菌体 (携带抗生素生物合成基因片段) amp , antib－
噬菌体整合在染色体的抗生素生物合成基因簇上 (质粒抗生素抗性, 无抗生素活性)
R
挑选突变克隆菌株的过程
抗生链霉菌 质粒载体 pIJ702
提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形质粒 DNA 片段 5’ 脱 磷酸 酶切
连接酶连接
受体菌 S.Lividans 重组质粒
·
·
·
转化原生质体 原生质体
·
筛选的目标：挑选呈紫红色的菌落 原理：吩恶嗪酮合成酶在受体菌 S.Lividans 中表达后使菌落呈紫红色。
2.克拉维酸生物合成基因: 棒状链霉菌S.clavuligerus
3.Tetracenomycin 生物合成基因
十一烷基灵菌红素生物合成阻断变株的互补
天蓝色链霉菌 质粒载体 pIJ702 提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形质粒 DNA 片段 连接酶连接 天蓝色链霉菌 十一烷基灵菌红素 生物合成阻断变株 重组质粒 重组质粒 · 5’ 脱 磷酸 酶切
. 8．筛选产物超表达变株，以
十一烷基灵菌红素
天蓝色链霉菌 A3（2）
克隆正调节基因
.
（1）克隆到标准宿主然后检测单个基因产物
例1. J.A.Gil and Hodwood, Gene (1983), 25:119-132 杀假丝菌素(Candicidin)
对-氨基苯甲酸合成酶
灰色链霉菌(S.griseus IMRU 3570) 生物合成途径: 莽草酸 酸 克隆的策略: 杀假丝菌素 分支酸
，无法对整个基因组进行操作，必须将整个基因组DNA
分成很小的片段（小于40KB）才便于研究。 4 通常的载体只能携带小于40KB的外源DNA片段。
基因组DNA（Genomic DNA)的制备
为了构建基因文库，需要对基因组DNA进 行提取，包括采用蛋白酶对微生物细胞进行消化， 采用酚和氯仿提取的方法除去蛋白。 得到纯度较高的基因组DNA后，再用限制性 内切酶将其切成适合与载体连接的长度，有时需 要用多种内切酶结合使用来制备DNA片段。
3. 链霉菌的分子生物学及其研究方法
链霉菌分子生物学的研究是在基因水平阐明次级代谢 产物生物合成与基因和酶的相互关系。是从本质上认识抗 生素等次级代谢产物生物合成过程的科学。 为了从基因的水平上研究抗生素等次级代谢的生物合 成过程，首先需要克隆抗生素生物合成基因。
主要内容
(一). 克隆抗生素生物合成基因的一般过程 (二). 克隆抗生素生物合成基因簇的策略和方法 (三). 抗生素生物合成基因精细结构的研究 (四). 基因生物功能的研究
基因文库的大小（Size of
library）
Fra Baidu bibliotek
为了使任意一个基因能够以较高的概 率被克隆到，一个基因文库必需包含足够 数量的重组子（带有目的菌株DNA片段 的载体）。这个数量的值可以由已知 DNA片段的平均长度计算得到。
计算基因文库大小的公式
ln (1-p) N= ln (1- f )
N：基因文库需要的重组子数量
（5） 人工合成寡核苷酸探针探测相应菌体的基因文库
根据代谢产物生物合成酶的氨基酸序列设计DNA中
的核苷酸序列, 并合成一段该序列的放射性探针, 利用菌
落杂交技术, 克隆阳性菌落。 .
.
GGATCCAGCATGCAGG
基因文库（gene library)
许许多多独立克隆的集合体我们把它叫做基因文库。 Genomic library:gene library made from genomic DNA are called genomic library cDNA library: gene library made from complementary DNA are known as cDNA library
细胞内。 4 获得重组体分子的转化子。
如何克隆到目的基因
链霉菌染色体的大小约为 8000KB 大多数基因的大小为 1 KB，通过普通质粒克隆到的DNA片段 大多数为5 —— 20KB.
如何确保克隆到任何一个目的基因？
答案：需要数量足够多的独立克隆。 由于单个基因仅占染色体DNA分子总量极其微小的比例， 为了使拟克隆的基因不被遗漏，需要许多不同的独立克隆。 独立克隆：每个克隆带有的DNA片段都不相同。
人类基因文库大小的计算
ln (1-0.99 ) Nhuman = ln〔1- (2×104/3×109 ) 〕 = 6.9×105
不同载体对基因文库大小的影响
载体类别 插入片段平均大小 KB 5 23 45 需要独立克隆数* 多 较少 少
大肠杆菌质粒 λ 噬菌体 cosmid
* 指构建大肠杆菌基因文库所需的独立克隆数
再生 (筛选带重组质粒的转化子)
目的克隆菌株的筛选 .
如何识别重组子（菌落）
. 畜厩链霉菌 (产生头孢菌素 C) S.cattley NRRL8057 质粒载体 pIJ943 提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形质粒 20～40 kb DNA 片段 连接酶连接 变青链霉菌 1326 5’ 脱 磷酸 酶切
P：克隆到目的基因的概率 f：插入片段长度(bp)与基因组DNA长度的比值(bp)
大肠杆菌基因文库大小的计算
大肠杆菌基因组的大小为 4.6×10 6 bp
如果重组子中连接大肠杆菌DNA片段的平均长度为2×104 bp, 则以99%的概率克隆到任一基因所需的独立克隆(重组
子)数量为：
ln (1-0.99 ) NE.coli = ln〔 1- (2×104/4.6×106 ) 〕 = 1.1×103
合成途径:
2分子 4-甲基-3-羟基邻氨基笨甲酸
吩恶嗪酮合成酶 发色团 actinocino
放线菌素 克隆的策略: 目标: 首先克隆吩恶嗪酮合成酶基因 策略: 吩恶嗪酮合成酶基因在链霉菌菌S.Lividans中表达后, 发色团使转化子的菌 落呈现紫红色, 因而可以用肉眼识别出阳性菌落.
吩恶嗪酮合成酶基因的克隆
(一）. 克隆抗生素生物合成基因的一般过程
. 供体菌(链霉菌) 载体 (含有适当质粒的链霉菌) 受体链霉菌
培养菌丝体
培养菌丝体 培养菌丝体
分离和纯化染色 体 DNA
分离载体 DNA (质粒) 制备原生质体 酶切
酶切 5’脱磷酸 ( CIAP/BAP) DNA 片段大小 的分离
DNA 连接酶连接
转化原生质体
酶切 线形质粒 5’ 脱 磷酸
连接酶连接 受 体 菌 (对 氨 基苯 甲酸合成酶缺陷型 变株) — S.Lividans (Pab )
重组质粒 转化原生质体
原生质体
筛选的条件：基本培养基 原理：若转化子不含有对氨基苯甲酸合成酶基因，则不能在基本培养基上生长。
例2. 放线菌素生物合成基因的克隆
G.H.Jones and D.A.Hopwood , J.Bio.chem,1984,259:14151-57 抗生链霉菌( S.antibioticus) 放线菌素
在细胞水平上，涉及胚胎学，免疫学及细胞生物学等学
科，克隆一词是指由同一祖细胞（progenitor cell)分裂而来
的一群遗传上同一的子细胞群体。 在分子水平上，诸如分子生物学和分子遗传学学科，凡 带有一段DNA插入序列的，独立的寄主/载体单元（例如， 大肠杆菌寄生细胞中的重组质粒载体）也称为克隆。
对-氨基苯甲
目标: 首先克隆对氨基苯甲酸合成酶基因
策略: 用变青链霉菌对氨基苯甲酸合成酶缺陷型变株 S.Lividans (Pab—) 作为克隆的宿主。
例1. 对氨基苯甲酸合成酶基因的克隆
灰色链霉菌(S.griseus IMRU 3570)
链霉菌 质粒载体
提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 DNA 片段
我们通常所说的基因克隆，实质上包含着待研究的目 的基因的分离和鉴定两个主要内容。而整个基因克隆 的过程则包括如下四个基本步骤。
基因克隆的四个基本步骤
1 用于基因克隆的DNA材料的选择，及DNA分子的片段化。
2 外源DNA片段与载体分子的体外连接。
3 将人工重组的DNA分子导入到它们能够正常复制的寄主
十一烷基灵菌红素生物合成阻断变株的互补
天蓝色链霉菌 S.coelicolorA(3)2 目的: 克隆十一烷基灵菌红素生物合成基因 策略: 以十一烷基灵菌红素生物合成阻断变株作为受体菌 目标: 筛选抗生素生物合成能力恢复的变株 十一烷基灵菌红素
用本策略克隆到的抗生素生物合成基因簇还有： 1. 链霉素生物合成基因 : 灰色链霉菌S.griseus
基因克隆 Gene Clone
“克隆”一词最早来源于来源于拉丁语，指的是无性繁殖。 在当今生命科学的各个领域， “克隆”一词被广泛地使 用。它不仅在词义上有名词和动词之分，而且在不同的学 科之间和不同的的研究层次上也有不同的含义。
在多细胞的高等个体水平上，例如植物与动物，人
们用克隆表示由具有相同基因型的同一物种 的两个 或多个个体组成的群体。例如，从同一受精卵分 裂而来的单卵双生子（monozygotic twins)便是属于 同一克隆。
（2）生物合成阻断变株的互补
某种代谢产物产生菌经过诱变剂的作用后,丧失了合成 这种代谢产物的能力, 这样的菌株称为 “生物合成阻断变株”。 以这样的阻断变株作为受体菌, 制备成原生质体, 将连接酶连
接后的重组质粒转化该原生质体, 如果得到某个转化子恢复
了代谢产物(如抗生素)的生物合成, 则表明克隆到了该代谢 产物(如抗生素)的生物合成基因。
重组质粒 转化 原生质体
筛选 30，000 多菌落，从中找到一株具 有抗菌活性的转化子 PE15-1。
PE15-1
发酵 产物分析（HPLC）
提取质粒
.
（二）. 克隆抗生素生物合成基因簇的策略
1. 克隆到标准宿主 （如变青 链霉菌） 然后检测单个基 因产物 2．产生菌阻断变株的互补 杀假丝菌素（对-氨基苯甲酸合 成酶） 放线菌素（苯氧连氮合成酶） 放线紫红素 克拉维酸 链霉素 3． 抗生素生产菌株突变克隆 4．先克隆抗性基因，然后再 探测与其连锁的其它基因 次甲霉素 土霉素 红霉素 嘌呤霉素 5． 用人工合成的寡核苷酸探 针探测基因文库 6． 克隆整个生物合成基因簇 到非抗生素产生菌中 7． 利用一种已克隆的基因片 段，探测其它菌基因库 中的同源基因 头霉素（Cephamycin） 次甲霉素 榴霉素 泰洛星（Tylosin） 抗生链霉菌 IMRU 3720 天蓝色链霉菌 A3（2） 棒状链霉菌 A TCC27064 灰色链霉菌 A TCC10137 天蓝色链霉菌 A3（2） 龟裂链霉菌 红色链霉菌 NRRL2338 白黑链霉菌 A TCC12461 弗氏链霉菌 （S.fradiae） S.Cattleya NRRL8057 天蓝色链霉菌 A3（2） 紫红链霉菌 （S.violaceoruber TU22） 灰色链霉菌 IMRU 5370
转化
原生质体
点种
保湿培养
生物活性检测
（3）抗生素生物合成基因的突变克 隆(mutational cloning)
链霉菌 (产生抗生素) 噬菌体载体
提取染色体 DNA 酶切 分离 DNA 片段 线形噬菌体载体 DNA 片段 连接酶连接 5’ 脱 磷酸 酶切
重组噬菌体 .
突变克隆(mutational cloning )的过程
基因文库的特点
比较 存放的内容 检索方式 得到方法 library books gene library gene (重组子） 无目录可查 大量筛选
有目录可以检索 到指定的位置取
研究基因为什么要先克隆基因？
1 基因太微小，无法直接观察到它们，必须借助其它实验
方法。 2 普通的实验手段很难观察到单个基因分子，必须观察 多个同样分子的群体。 3 DNA分子太“大”（链霉菌的基因组DNA大约为8000KB