马铃薯组织培养中的污染原因及控制措施

马铃薯组织培养中的污染原因及控制措施【摘要】组织培养是通过无菌操作分离植物体的一部分，接种到培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其产生完整植株的过程。在整个组织培养过程中，污染是一个普遍存在的现象，污染率高使组培的成本相应增加，甚至造成毁灭性损失。因此，控制污染是组织培养研究及工厂化育苗生产中一个重要环节，也是一套贯穿整个组培过程的技术。

【关键词】植物组织培养；无菌操作；污染

1.污染的症状和原因

真菌性污染主要指霉菌引起的污染。一般接种后3～8d可在培养基中发现各种颜色的菌斑。真菌性污染，一般是由空气污染和瓶口边缘的灰尘和真菌孢子落入器皿中造成的。另外，在湿度太大的季节和培养室内，棉塞也会长出真菌孢子引起大量污染。

细菌性污染是指在培养过程中，工作人员使用了未经充分消毒的工具，在培养基表面或材料表面出现黏液状物体、菌落或浑浊的水渍状，有时呈现泡沫发酵状[4]。一般在接种后1～2d即可发现。细菌污染又以芽孢杆菌最普遍、最严重。这种芽孢杆菌能耐一定高温、高压，对消毒剂和紫外线也有一定抗性。常由于高压灭菌不彻底造成的。因此，每次培养基灭菌后，应放在培养室2～3d。看培养基表面和内部无任何细菌痕迹，才能使用。

2.影响污染的因素

2.1培养基消毒

培养基的污染以细菌污染为主，主要表现为：培养基表面出现黏液状物质、菌落或呈浑浊的水渍状甚至泡沫发酵状，其中芽孢杆菌发生最为普遍和严重，呈乳白色。可随培养材料、用具等传播，也可出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在于培养基内。这种菌外包有夹膜，能耐一定的高温、高压，对紫外线有一定的抗性，一般消毒剂也难以杀死[2]。

2.2外植体

植物组织培养的成败除与培养基的组分有关外，另一个重要因素就是外植体本身，即由植物上切取下来，用以进行离体培养的那部分组织或器官。在继代培养中，一定要严格筛选无污染的外植体。对于某些存在于接种材料内部的内生细菌，由于它潜伏的较深，在外植体的初级培养中不易被发现随着继代次数的增加，菌量慢慢累积发展才在培养基上显现出来，一般的表面消毒方法无法将其消除，会随着材料带入培养过程引起污染。

2.3接种室与接种器械

植物组织培养包括无菌操作和无菌培养技术，做好无菌操作室的消毒是至关重要的。污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子。接种室内不干净，接种工具—镊子、剪刀以及培养瓶等落有灰尘，都可引起真菌生长。一般定期开窗换气，以免造成细菌周期性大面积发生。

2.4培养条件

在培养室内的培养条件中，温度和湿度与污染率密切相关。组

培苗在高温、高湿环境下有利于杂菌滋长，所以污染率就高；温度冷、凉培养时，污染率就相对低一些。当发现污染的组培苗时，一定要及时清理。在植物病害中，真菌所引起的病害尤其严重，且因会产生孢子，随着空气飘散，一旦落入适当的环境下，一粒小小的孢子便会扩大成一个菌落，污染整个组织培养瓶。因此一旦有真菌污染的组培苗，就要用高压灭菌器彻底消灭，以防扩散。

3.防治措施

3.1培养基的灭菌

培养基封口后应尽快进行高温高压灭菌。灭菌不及时，会造成杂菌大量繁殖，使培养基失去效用。为了保证培养基灭菌彻底，降低污染，在灭菌过程中需注意以下几个环节：

①锅内灭菌物不能堆放过满，否则将阻碍蒸汽的流通和热交换，使容器内升温减慢，造成物体内部杀菌不完全。

②压力升到0.5kg/cm2时打开放汽阀，将锅内冷空气彻底排放干净，防止灭菌不彻底，然后再关闭放汽阀，使压力稳定。

③在压力1.1kg/cm2、温度为120～121℃下持续灭菌15～25min，灭菌时间不宜超过30min，以免引起培养基成分变化。

据报道，对于一些内生细菌可在培养基中加入一定浓度的抗菌素（青霉素na 120mg/l +链霉素40mg/l），对其污染可起到一定程度的抑制作用[3]。

3.2基础苗的表面消毒

①在接种之前，基础苗需经严格的挑选，仔细观察待转基础苗，

清除已被污染的基础苗，确认无污染才能取用。

②对于一些初期感染的基础苗，由于菌源太小，肉眼不易发现，不确定是否被污染的基础苗也应果断清除。

③用75%酒精擦拭培养瓶的外壁（及瓶盖），消除附着在瓶外壁上的杂菌后放在超净工作台中，用紫外灯消毒20～30min备用。

3.3接种过程的注意事项

接种的基本技术环节是降低污染率的关键措施。在接种中，为了降低污染，应注意以下几项事宜：

①接种室保持干净整洁，应定期对接种室用75%酒精进行喷雾降尘和熏蒸（甲醛∶高锰酸钾=2∶1）灭菌[4]，并定期对接种室进行20～25min的紫外灭菌。在每次接种前，用紫外灯光照射、杀菌30～35min。

②接种过程中操作人员应及时用75%酒精擦拭双手和超净工作

台台面及台壁。接种过程中，瓶子呈斜角，瓶口放在酒精灯火焰上方，利用气流上升的原理，以阻止空气中飘扬的孢子落入瓶内。接种后，再烧瓶口一次，瓶盖要拧紧、拧严。

③接种器械应及时在酒精灯火焰上进行灼烧灭菌，每接一瓶所用器械消毒一次。台面上尽量少放瓶子保证气流畅通。使操作区空气不断净化。

注：若长时间使用一种消毒药剂，空气中散落的真、细菌孢子就会产生抵抗不利环境的抗性，所以应该每隔一段时间就更换一种消毒液。如：过氧乙酸。

3.4组培苗的生长环境的调控

培养室是组培苗生长的室内环境，除保持培养物适宜的生长环境（相对温度20℃～24℃、相对湿度70%～80%、光照强度1800lx～2500lx）外，组培室的清洁消毒和污染防控是组培实施工厂化生产不可忽视的问题。因此，每隔2～3d用甲醛溶液或百菌清洒地消毒一次，每隔4～5d用甲醛熏蒸（将50ml甲醛倒入15g左右高锰酸钾中[5]，使甲醛蒸汽散发出来，密闭接种室门窗24h），杀死空气中的污染菌源，同时结合75%酒精作降尘处理（喷雾）。用0.5%的新洁尔灭溶液擦洗培养架。另外要及时清除组培室中的污染菌和污染苗，集中进行高温灭菌或远距离销毁，以消灭污染源。

【参考文献】

[1]曹孜义，刘国民.实用植物组织培养技术教程[m].兰州：甘肃科学技术出版社，1992.

[2]李清萍.降低马铃薯组培苗工厂化生产中污染率的有关措施[j]中国马铃薯，2002，16（4）：230-231.

[3]黄萍，颜谦，童安毕，等.马铃薯茎尖培养及快速繁殖抗污染的效果研究[j].贵州农业科学，2003，31（3）：44-45.

[4]杨萍，张涛.马铃薯脱毒试管苗接种污染原因及防除技巧[j].内蒙古农业科技，2005，（7）：21-22

[5]柴向华，李军，张秀珊等.植物组织培养中污染的控制[j].热带农业科学，2003，23（6）：40-44.