大肠杆菌基因工程ppt课件

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工程菌遗传不稳定性的表现形式
分配不稳定性（主要） 整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）。 导致表达水平下降。 结构不稳定性 重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修 饰，导致其表观生物学功能的丧失（不表达、 产物结构改变）
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重组质粒的逃逸： 工程菌部分细胞因质粒丢失而不再携带重组质粒的现象。
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工程菌构建主要研 究内容
3、目的基因获得、分析与优化
克隆、合成、索要？
n 翻译起始位点与终止密码子：头尾不要缺，中间不能断 n GC含量：＞70%时表达水平低 n 二级结构 ： mRNA 二级结构抑制翻译的起始或终止。 n 基因或者蛋白的大小：一般说来小于 5kD 或者大于
100kD 的蛋白都是难以表达的。前者融合表达，后者截取 表达（如抗原用途，选抗原性强、好表达区段）。 n 疏水性：疏水性强的、特别是膜蛋白难表达。截取表达。 n N端和C端稳定性 ：人为突变末端残基。
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pET21a质粒物理 图谱
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pET21a质粒多克隆位点与表达盒
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pET32a质粒物理 图谱
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pET32a质粒多克隆位点与表达盒
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pET32a-VL-Δω酶切鉴定
M1 2 3 4
目的基因： VL-Δω, 表达载体：pET32a M：Maker，1kb lader 1：PCR产物，引物含NcoI、HindIII 2：HindIII单酶切pET32a质粒 3：NcoI-HindIII双酶切重组子 4：HindIII单酶切重组子
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改善基因工程菌不稳定性的策略
1、改进载体-宿主系统
选择特定质粒最适宿主菌株 选择性地杀死无质粒细胞
如敲除宿主基因组致死性基因（如ssb基因，缺失无法DNA 复制），并将其改由表达载体提供
正确设置载体上的多克隆位点，避免DNA片段插在 稳定区内
使用可控型复制子（扩增与表达诱导同步)
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转化与表达筛选 表达产物确证
工程菌稳定性分析
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工程菌菌种保存
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工程菌构建主要研 究内容
1、目的蛋白分析：
糖基化？难表达？难复性？药用？
1)理化特性()
*分子大小：≤5KD、≥100KD难表达（融合表达、截短表 达）
*氨基酸组成：Cys、Pro多的难表达（用真核系统）
*疏水性：疏水性强的难表达（截短表达、用真核系统）
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改善基因工程菌不稳定性的策略
2、施加选择压力
根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应 的抗生素 药物和食品生产时不宜使用抗生素 采用营养缺陷型宿主菌，载体含营养标记，培养基 不含该营 养组份
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工程菌构建主要研 究内容
4、表达载体构建与分析
1）根据选定载体物理图和基因特点设计与构建
PCR扩增目的基因：
*引物中引入适当的酶切位点，避免基因内部位点。
*是否需要目的基因带入ATG和TAA？是否要对框？
2）表达载体酶切分析：双酶切、多酶切图谱分析
3）目的基因序列分析：目的基因或表达盒序列分析
重组质粒的宏观逃逸率： 工程菌培养液中丢失质粒的细胞占细胞总数的百分比。
非选择性平板菌落数-选择性平板菌落数
宏观逃逸率（%）=
非选择性平板菌落数
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重组质粒逃逸的原因
目的基因本底表达产物引起的毒性反应
关闭质粒DNA合成途径，启动降解程序
目的基因高效表达诱导宿主细胞产生应激反应
抗性标记基因过表达，抗生素消耗过快。
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工程菌构建主要研究 内容
5、转化与表达筛选
1）转化选定的工程菌宿主株（不同于克隆 宿主菌！）
2）表达筛选：以表达水平（%）为指标。
表达水平（%）=目的产物占总蛋白的百
分数
测定方法：SDS-PAGE+凝胶扫描分析
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工程菌构建主要 内容
6、表达产物确证
1）基本要求：SDS-PAGE + Western-Blot
四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化
五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例
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四、工程菌构建、发酵与产物分离纯 化
• 工程菌构建
• 发酵工艺研究
• 分离纯化工艺研究
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工程菌构建研究内容与 技术路线
目的蛋白分析
表达载体构建与分析
表达载体与宿主 菌株选择
目的基因的获得 与优化
2）特殊要求（如基因工程药物）：
A、结构：末端顺序（N-端15个/C端3个）、氨基
酸组成、肽图等
B、理化特性：分子量（SDS-PAGE、质谱）、等电点、
紫外特征吸收峰等
Leabharlann Baidu
C、生物学活性
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7、工程菌遗传稳定性分析 大肠杆菌工程菌的不稳定性
基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 改善工程菌不稳定性的策略 工程菌遗传稳定性分析
1）表达载体选择
启动子、标签、标记基因、拷贝数等。
需要可溶表达时采用弱启动子，T7启动子最强，PL/PR 热激诱导不宜工业化。
从蛋白特性、用途、发酵和分离纯化工艺考虑标签。
药用避免氨苄青霉素，用卡拉霉素。
4）宿主菌：符合表达要求（T7 RNA酶溶源？可溶？稀有
密码tRNA？），来源与PPT遗学习传交流 背景清楚，资料翔实。
基因工程 Genetic Engineering
Email: 任课教师：张文峰、陈伟
２０13
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第三章 大肠杆菌基因工程
Escherichia coli （SEM，×14000）
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第三章 大肠杆菌基因工程
一、 大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点 二、大肠杆菌表达系统高效表达原理 三、工程菌构建策略
目的基因表达盒“转录过头”，影响Ori区域。 环境因素诱导的重组质粒渗漏
高温、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（吖啶）
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重组质粒结构不稳定性的产生原因
宿主细胞中的修饰性酶系对外源重组DNA分子的破坏 宿主细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 环境因素诱导的突变
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2)生物学特性：膜蛋白难表达（截短表达、用真核系统）
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工程菌构建主要研 究内容
3)用途 药用：安全性、产量、成本（包涵体、独立表达） 工业用：产量、成本（包涵体、独立表达） 研究用：迅速获得活性产品为首要考虑（可溶、融合表达）
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工程菌构建主要研
究内容
2、选择表达载体与宿主菌株：