第十一章 核酸的物理化学性质

盐浓度对DNA变性的影响
RNA的变性：RNA也具有螺旋 线团 之间的转变。但这种较变不如DNA明显。 变性曲线不陡， Tm值较低。tRNA具有较 多的双螺旋区，所以具有较高的Tm值， 变性曲线也较陡。
（二）复性 变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双 螺旋结构的过程称为复性。
核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）
技术
核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿 卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington） 的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理 是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或 RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区 段将会退火形成双链的结构。
<2>核酸分子杂交的技术 Southern Blotting（南印迹）：用于钓基因，即用已知 的DNA单链或RNA，钓取未知DNA分子中的基因，方 法如下： 未知的DNA --DNA限制性内切酶 DNA片段 琼脂糖电泳分离 碱液变性 影印在硝酸纤维薄 膜上 与放射性标记的已知DNA单链或RNA杂交 放射自显影 Northern Blotting（北印迹）：用已知的DNA钓 mRNA，方法如下： 众多未知的RNA 电泳分离 变性 影印 用标记的已知DNA单链杂交 放射自显影 Western Blotting（西印迹）：蛋白质与抗体的杂交， 跟核酸无关。
四.核酸的变性，复性及杂交 (一) 变性
稳定核酸双螺旋的次级键断裂，空间结构破坏，变 成单链结构的过程。核酸的一级结构(核苷酸顺序)保 持不变。 变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫 外吸收增加（增色效应） 变性因素 pH（>11.3或<5.0） 变性剂（脲、甲酰胺、甲醛） 低离子强度 加热
（三）核酸的杂交 DNA单链与在某些区域有互补序列的异源 DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。 这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具 有重要意义。 Southern 杂交（Southern bolting） Northern 杂交（Northern bolting） Western 杂交 （Western bolting）
（a）
基因组DNA
Southern
Hale Waihona Puke DNA限制片段凝胶转移
杂交技术
（b）
（ c）
（d）硝酸纤维素滤膜
同探针同源杂交 的基因DNA片段 X光底片
（ e）
Southern Blotting
DNA
DNA Marker
migration
Paper towels
Gel Salt
solution
Northern RNA印迹技术（Northern blotting）
DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一 般只能得到部分的恢复，具有减色效应。
将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。 变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。 退火温度＝Tm－25℃ 复性影响因素 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/ 溶液离子强度
将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能复 性 DNA的片段越大，复性越慢 DNA的浓度越大，复性越快 在一定条件下，复性反应的速度用Cot 1/2来衡 量，Co为变性DNA复性时的初始浓度，t为时 间， Cot ½表示复性一半时的DNA浓度。 两种浓度相同但来源不同的DNA，复性时间的 长短与基因组的大小有关 有很多重复序列的DNA复性也快
热变性与Tm
DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度 区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量 达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。 （或者把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一 半时的温度称为该 DNA的熔点或熔解温度）。 一般DNA的Tm值在82-95C之间。
DNA的Tm值大小与下列因素有关： （1）DNA的均一性。均质DNA，如一些病毒的 DNA，人工合成的poly d(A-T),poly d(G-C)熔 解过程发生在一个较小的范围内。异质DNA熔 解的过程发生在一个较宽的范围内。所以Tm 值可作为衡量DNA样品均一性的标准。 （2）分子中G和C的含量。 G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可 反映DNA分子中G, C含量，可通过经验公式计 算：（G+C)%=(Tm -69.3) Χ 2.44 （3）介质的离子强度。一般离子强度较低的介 质中，DNA的熔解温度较低，而且溶解温度的 范围较宽。
核酸的杂交
<1>核酸分子杂交的意义： 发现原核生物的基因是连续基因，而真核生物 的基因是断裂基因。 连续基因：基因中的bp序列能够连续的在成熟 的蛋白质中找到其相应的AA，电镜显示这种 基因能够和它的成熟mRNA形成平滑的杂交分 子。 断裂基因：基因中的bp序列能够断续的在成熟 的蛋白质中找到其相应的AA，电镜显示这种 基因和它的成熟mRNA只能形成带泡的杂交分 子。 发现癌基因的普遍性：肿瘤病毒的RNA能够与 人类正常的DNA分子形成带泡的杂交分子。
核糖核酸酶举例 牛胰核糖核酸酶（ RNase I）,内切酶，水解嘧 啶3'-磷酸和其他核苷酸5 ' -OH形成的酯键，产 生3 ' -磷酸核苷。 核糖核酸酶T1，内切酶，发现于米曲霉，水解 3 ‘ -鸟苷酸与其他核酸5 ’ -OH形成的酯键， 产物为3 ‘ -鸟苷酸为末端的寡核苷酸。
脱氧核糖核酸酶举例
1.牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase I），内切酶，水解DNA 3 ‘ -磷酸酯键，产生5 ’ -磷酸的寡核苷酸，平均长 度为4个核苷酸。 2.牛脾脱氧核糖核酸酶（DNase II），内切酶，水解DNA 5 ‘ -磷酸酯键，产生3 ’-磷酸的寡核苷酸，平均长 度为6个。 3.限制性内切酶，可识别特异的碱基序列并水解断开，产 物带5 ‘ -磷酸基，已发现数千种，是基因工程的重要 工具酶。 N-糖苷酶 水解糖苷键，产物为含氮碱基和无碱基末湍的寡核苷酸
1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分 子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰 的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于 这种方法与Southern DNA印迹杂交技术十分类似，所 以叫做Northern RNA印迹技术（Northern blotting）。 将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上， 然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行 反应，这种技术叫做Western蛋白质杂交技术 （Western blotting）。
二.核酸的酸碱性质
两性解离：DNA无，只有酸解，碱基被屏蔽 （在分子内部形成了氢键）。RNA有两性解离， 有pI。核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解 离，因此核酸是两性电解质 碱基的解离：嘧啶和嘌呤环上的 N及各取代基 具有结合和释放质子的能力。 核苷的解离：碱基和核糖具有结合和释放质子 的能力 核酸的解离：磷酸基具有较强的酸性，核酸的 两性解离主要决定于磷酸基和含氮碱基。
样品中如含有杂蛋白及苯酚，比值明显 降低。 对于纯的样品，只要读出260nm的A值即 可算出含量。通常以A值为1相当于 50µ g/ml 双螺旋DNA，或40 µ g/ml单链 DNA（或RNA），或20 µ g/ml寡核苷酸 计算。
有时核酸的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示，摩尔 磷即相当于摩尔核苷酸。 先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出 摩尔磷吸光系数ε(P) 。 ε(P)=A/cL A为吸收值，c为每升溶液中磷的摩尔数，L为比色杯内径。 c=每升中磷的重量（克）W/磷的原子量（30.98） ε(P)=30.98 A/WL 一般天然DNA的ε(P)为6 600，RNA为7 700-7 800。核 酸的ε(P)值较所含核苷酸单体的ε(P)要低40%-45%。 单链多核苷酸的ε(P)值比双螺旋结构多核苷酸的ε(P)要 高，所以核酸发生变性时， ε(P)升高约25%，此现象 称为增色效应（hyperchromic effect）。复性后ε(P)又 降低，这现象称减色效应(hypochromic effect)。
第十一章 核酸的物理化学性质
一.核酸的水解 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下 水解切断。 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。 例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可 以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在 同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差 别，与RNA核糖基上2′-OH参与作用有很大的 关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基， 在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在 碱的作用下形成水解产物。
三.核酸的紫外吸收 在核酸分子中，由于嘌呤碱 和嘧啶碱具有共轭双键体系， 因而具有独特的紫外线吸收 光谱，一般在260nm左右有 最大吸收峰，可以作为核酸 及其组分定性和定量测定的 依据。 以A260/A280进行定性、定量 DNA和RNA溶液中加入溴化 乙锭（EB），在紫外线下发 出荧光。 用A260/A280还可用来表示 核酸的纯度： 大于1.8，DNA很纯； 大于2， RNA很纯。
Southern DNA印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中 分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上， 然后通过同位素标记的单链DNA或 RNA探针 的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种 实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由 E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫 Southern DNA 印迹转移技术。
酸易水解N-糖苷键，嘌呤碱基比嘧啶碱 基易被酸水解，脱氧核糖比核糖的糖苷 键易水解，DNA的嘌呤碱在pH2以下即 脱落而成嘌呤酸。 碱易水解磷酸酯键，RNA在0.3N碱中即 被水解，DNA对碱相对稳定。
酶水解
生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解 多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。 核酸酶的分类 按 底 物 专 一 性 分 ： 以 DNA 为 底 物 的 DNA 水 解 酶 （DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。 按作用方式分：核酸外切酶和核酸内切酶。 核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（ 3′端或5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶 的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中 间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。 按作用键分：水解3-磷酸酯键和5-磷酸酯键的核酸酶， 产物分别是5-磷酸核苷和3-磷酸核苷