细菌耐药表型检测

细菌耐药表型的检测

细菌耐药机制：

1.产生药物灭活酶：细菌通过耐药因子可产生破坏抗生素或使之失去抗菌活性的酶，使药物在作用于菌体前即被破坏或失效。水解酶：主要是β内酰胺酶，包括广谱酶、超广谱酶、金属酶、AmpC酶。钝化酶：氨基糖苷类钝化酶，使氨基糖苷类抗生素分子结构发生改变，使药物不易进入细菌体内。修饰酶：

2．抗菌药物作用靶位的改变：细菌通过改变药物作用靶位的结构来降低药物和细胞靶位的亲和力，引起对抗菌药物的耐药性。如细菌可改变青霉素结合蛋白（PBP S）的结构，降低与β—内酰胺类抗生素的亲合力，减少细菌与β—内酰胺类抗生素的结合，从而对β—内酰胺类抗菌药物耐药。

3.细菌细胞膜通透性改变：抗菌药物不易进入由于细菌细胞壁或细胞膜通透性的改变，致使抗菌药物无法进入细胞内而发挥抗菌作用。细菌可改变细胞壁的孔蛋白通道，使青霉素类、头孢菌素类和氨基糖苷类抗生素不能进入菌体；

4.细菌将抗菌药物泵出细菌细胞外（外排泵）：细菌还可合成新的蛋白插入细胞膜即产生新的膜转运系统，对抗菌药物产生外排作用，近年来发现了许多临床常见致病菌具有与其多重耐药相关的主动外排系统或外排泵，如绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌、淋球菌等，促使抗菌药物快速从菌体排出，从而导致细菌的耐药性。

总之,细菌耐药性机制是一个相当复杂的问题，其中，细菌产生灭活酶或钝化酶引起的耐药性在临床上具有重要意义。多重耐药菌往往综合上述几种耐药机制，使之对许多抗微生物药物产生耐药。细菌耐药性的发生和发展是抗微生物药物的广泛应用，特别是无指征滥用的后果。

一、β-内酰胺酶检测

使用范围：葡萄球菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡它莫拉菌。

方法：头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸片→灭菌水湿润→涂测试菌（G+菌可直接挑待测菌；G-菌提取细菌裂

解液）于纸片上，10min观察纸片颜色，显红色为阳性（葡

萄球菌应放置1h内观察）。

临床意义：若β-内酰胺酶阳性，则提示:

流感、淋病、卡它对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药

葡萄、肠球对青霉素、氨基、羧基、脲基青霉素耐药

对产该酶的菌株禁止应用青霉素类、广谱青霉素类抗菌药物，应根据药敏试验结果应用含酶抑制剂药物或头孢菌素联合氨基糖苷类或氟

喹诺酮类，根据情况可选用糖肽类及碳青霉烯类抗菌药物。

二、ESBLS检测

使用范围：大肠、肺克、产酸克雷伯、无菌体液中的奇异变形

方法：（1）纸片扩散初筛：头孢他啶（30μg/片）抑菌圈≤22mm

头孢噻肟（30μg/片）抑菌圈≤27mm

头孢曲松（30μg/片）抑菌圈≤25mm

氨曲南（30μg/片）抑菌圈≤27mm （2）双纸片协同确认试验：

头孢他啶（30μg/片）与头孢他啶（30μg）/克位维酸（10μg）

头孢噻肟（30μg/片）与头孢噻肟（30μg）/克拉维酸（10μg）

任意一组两纸片抑菌圈相比≥5mm即为ESBLS。

临床意义：阳性者对青霉素、一二三代头孢、单环β-内酰胺类均耐药，对氨基糖苷类、氟喹诺酮类不同程度耐药。应首选碳

青霉烯类，如泰能、美平；以及含酶抑制剂的复方制剂.

三、Ampc酶检测

使用范围：G-细菌（pea、产气、阴沟）

方法：双纸片测定：按常规药敏纸片扩散法在M-H琼脂平板上贴IMP(10μg/片)和CAZ（30μg/片）药敏纸片，相距10CM，

35℃孵育18-24h。CAZ近IMP侧抑菌圈半径出现扁平区为

阳性。

临床意义：常规的青霉素类、三代头孢菌素、β-内酰胺含酶抑制剂和β－内酰胺抗生素合剂往往对该类细菌无效。首选第

四代头孢菌素（如头孢吡肟）、碳青霉烯类、对其敏感的

非β－内酰胺类抗生素（如氨基苷类、喹诺酮类等）。

四、碳青霉烯酶（能被EDTA、巯基丙酸抑制）检测

使用范围：G-细菌

方法：表型筛查试验：纸片扩散法：

美罗培南（10ug）或亚胺培南（10ug）：抑菌圈直径≤22mm

肉汤稀释法或Etest法：美罗培南或亚胺南:MIC≥2ug/ml。

表型确证试验：

1.头孢他啶+2-巯基丙酸法(CAZ+NCA)

（1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板上分别贴两片头孢他啶(30ug/片)纸片，纸片中心相距2.5cm,将其中一片头孢他啶纸片上加3ul 2-巯基丙酸，35℃

孵育18-24h。

（3）结果观察：若加有2-巯基乙酸的头孢他啶纸片抑菌圈大于单个头孢他啶的抑菌圈（≧4mm），则为阳性，即产金属β-内酰胺

酶。

2.亚胺培南+EDTA法(IMP+EDTA)

纸片协同法（1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板上贴一片亚胺培南(10ug/片) 纸片，在距亚胺培南纸片中心1.5cm处贴无菌空白纸片一片，将0.5M EDTA 10ul 均匀浸注于空白纸片上，35℃孵育18-24h。（3）结果观察：若两片纸片抑菌圈有协同作用，则为阳性，即产金属β-内酰胺酶。

纸片扩散法：亚胺培南(10ug)/亚胺培南(10ug)+ EDTA(500mM 10ul)复合纸片结果判读：复合纸片比单药纸片抑菌环直径增大≥5mm 即为阳性。

3.改良Hodge试验MHT（主要检测肠杆菌科细菌产生KPC酶）

（1）ATCC25922配成0.5麦氏浊度，1：10稀释。

（2）用棉签满涂布于MH平板上，就像纸片扩散法药敏试验一样，在中心加一张厄他培南或美洛培南（最好）纸片。

（3）取待测菌从纸片边缘向外划（用1μl接种环）。阳性对照菌株：肺克ATCC BAA-1705；阴性对照菌株：肺克ATCC BAA-1706。

（4）35℃培养过夜后，观察结果。

（5）大肠沿着菌株划线的生长表明碳青霉烯水解酶的产生。

改良的Hodge试验：检测碳青霉烯酶活性的表型试验，在检测KPC方面有>90％的敏感性/特异性，检测其他碳青霉烯酶时敏感性/特异性不定（如：低水平的金属酶）。但此法为一种表型试验，不能将碳青霉烯酶分型。

临床意义：慎用碳氢酶烯类抗生素，可联合用药（含酶抑制剂+氨基糖苷类）。

五、D-Test试验

适用范围：葡萄球菌属

方法：(1）将待检菌按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H 平板上。