基因工程目的基因的获取

BamH I
gene
二、随机片断化
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1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。
（1）限制性内切酶的选用原则
① 内切酶识别位点的碱基数
影响所切出的产物的长度和随机程度。
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（3）连接酶连成完整双链
T4多核苷酸激酶 使5’-OH磷酸化 T4 DNA连接酶
完整的DNA双链
2. 互补延伸连接法资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
预先设计的片断之间有局部互补区，可以 相互作为另一个片断延长的引物，用DNA 聚合酶延伸成完整的双链。
5’
3’
CCC
粘性末端
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4. 基因组文库的大小
一个文库要包含99%的基因组DNA时所 需要的克隆数目。
N=
ln (1-p) ln (1-f)
Klenow片段 引物
5’
3’
T4DNA连接酶
5’
3’
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三、 寡聚核苷酸化学合成的优点
1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低
2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成
合成带有定点突变的基因片断。
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5. 合成人工接头或衔接物
含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或 衔接物（Linker）序列。
EcoRI Adaptor EcoRI Linker
DNA合成仪
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第三节 目的基因的保存和扩增
一、基因文库的构建
1. 基因文库（gene library）
（2）合成过程
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下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。
2. 磷酸三酯法
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原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的 单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先 连接了一个保护基团。
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① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端 都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
②人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
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各种酶的接头可以向公司定做或购买。
接上人工接头 ③ 同聚物加尾
粘性末端
末端转移酶 CCC
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。
② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。 （Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法
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（1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断 裂成约300bp的随机片断。
（2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb 的随机片断。
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第二节 化学合成目的基因
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法 合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。
一、目前常用的方法
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。 不能用一般的限制性内切酶消化法。
① 物理切割法：
超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 ② 酶切法：
内切酶Sau3A进行局部消化。可得到 10-30kb的随机片断。
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（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割 成大小合适的片断，并将所有这些片断 都与适当的载体连接，引入相应的宿主 细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生 物体的全部基因，称为基因文库。
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2. 构建基因文库的载体选用
载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构 建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
（1）对载体的要求
载体容量越大，所要求的DNA片断数目 越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体
载体系列： 容量为 24 kp
cosmid载体： 容量为 50 kb
YAC：
容量为 1 Mb
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
BAC:
容量为 300 kb
3. 基因文库构建的一般步骤 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 （1）染色体DNA大片段的制备
磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法
1. 磷酸二酯法
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（1）原理
① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH 保证合成反应的定向进行。
② 带保护的单核苷酸连接
带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一 个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。
③ 用酸或碱的脱保护
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二、 化学合成DNA片断的组装
化学合成的DNA片断一般在200bp以内。 1. 互补连接法
（1）互补配对
预先设计合成的片断之间都有互补 区域，不同片断之间的互补区域能 形成有断点的完整双链。 （2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端 带上磷酸。（合成的DNA单链的5’端是-OH）
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第一节 从基因组获取
一、限制性内切酶法
用限制性内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片断。
酶切
1. 优点
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由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。
2. 缺点
目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I BamH I
合成的二核苷酸连接处有三个酯键！
固相磷酸三酯合成法 将第一个核苷酸的3’OH端固定在固相支持物 上。 是目前通用的合成方法。
15
固相磷酸三酯合成过程 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
C
固相支持物
固相 支持物
固相 支持物
结果是全保护的DNA：5’ DMT, 3’固相支 持物, 核苷酸之间对氯苯。最后脱保护