GBT 18204.4-2013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物更改对照

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5.2
自然沉降法
5.2
撞击法
设置采样点时，应根据现 场的大小，选择有代表性 的位置作为空气细菌监测 5.2.1 的采样点。通常设置高度 为1.2～1.5m。采样点应远 离墙壁1m以上，并避开空 调、门窗等空气流通处。
5.2.1
仪器与设备 见3.2.1
将营养琼脂平板置于采样 点处，打开皿盖，暴露 5.2.2 5min，盖上皿盖，翻转平 板，置36℃±1℃恒温箱 中，培养48h。
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4.2
新增： 撞击法
4.2.1
新增： 仪器和设备 见3.2.1
4.2.2
新增：培养基
4.2.2.1 新增： 沙氏琼脂培养基成分
新增： 制法将蛋白胨、葡萄糖 溶于蒸馏水中，校正pH为5.5～ 4.2.2.2 6.0，加入琼脂，115℃，15min 灭菌备用。
4.2.3
采样 见3.2.3
4.2.4
5.1
撞击法
5.1
原理
选择有代表性的位置设置 采样点。将采样器消毒， 5.1.1 按仪器使用说明进行采样 。 样品采集完后，将带菌营 养琼脂平板置36℃±1℃恒 温箱中，培养48h，计数菌 落数，并根据采样器的流 5.1.2 量和采样时间，换算成每 立方米空气中的菌落数。 以每立方米菌落数（cfu/m ³）报告结果。 选择撞击式空气微生物采 样器的基本要求：a）对空 5.1.3 气中细菌捕获率达95%。 b）操作简单，携带方便， 性能稳定，便于消毒。
2
术语和定义：下列术语和定义适 用于本文件
2.1
2.1
新增：细菌总数 公共场所空气 中采集的样品，技术在营养琼脂 培养基上经35℃～37℃、48h培 养所生长发育的嗜中温性需氧和 兼性厌氧菌落的总数。
2.2
自然沉降法：指直径9cm的 营养琼脂平板在采样点暴 露5min，经37℃、48h培养 后，计数生长的细菌菌落 数的采样测定方法。
6.3.2.1 吸收液成分 制法：将酵母浸出粉加水至 1000mL，121℃下高压灭菌 6.3.2.2 15min，分装于灭菌后的离心管 （6.2.3）中备用。 6.3.3 盐酸氯化钾溶液溶液［с （HCL ·KCL)=0.01mol/L］
6.3.3.1 成分 制法：将上述成分混匀，用 1mol/L氢氧化钾调整pH=2.2± 6.3.3.2 0.2，121℃下高压灭菌15min备 用。 6.3.4 GVPC琼脂平板。 6.3.5 BCYE琼脂平板。 6.3.6 BCYE-CYE琼脂平板。 6.3.7 革兰氏染色液。 6.3.8 马尿酸盐生化反应管。 6.3.9 军团菌分型血清试剂。 6.4 采样 6.4.1 采样点：见附录A.
2.4
2.5
撞击法：采用撞击式空气微生物 采样器，使空气通过狭缝或小孔 产生高速气流，从而将悬浮在空 气中的微生物采集到营养琼脂平 板上，经实验室培养后得到菌落 数的测定方法。 自然沉降法：将营养琼芝平板暴 露在空气中，微生物根据重力作 用自然沉降到平板上，经实验室 培养后得到菌落数的测定方法。
2.6
2
内 容
4.3
自然沉降法
4.3.1
仪器与设备 见3.3.1
4.3.2
培养基 见4.2.2
4.3.3
采样 见3.3.3
4.3.4
检验步骤 见4.2.4
4.3.5
结果报告 计数每块平板上生长 的菌落数，求出全部采样点的平 均菌落数，检验结果以每平皿菌 落数（CFU/皿）给出。
5
操作步骤
5
β -溶血性链球菌
采样点β -溶血性链球菌结果计 算：菌落计数。记录结果并按稀 5.2.5.1 释比与采气体积换算成CFU/m³ （每立方米空气中菌落形成单 位）。
一个区域β -溶血性链球菌测定 结果：一个区域空气中β -溶血 5.2.5.2 性链球菌的测定结果按该区域全 部采样点中β -溶血性链球菌测 定值中的最大值给出。 6 嗜肺军团菌 原理 采用液体冲击法采样、培 养法定性测定公共场所空气中的 嗜肺军团菌。 仪器和设备 微生物气溶胶浓缩器：采样流量 ≥100l/min，对于直径3.0μ m以 上的粒子的捕集效率应≥80% （或浓缩比≥8）。 液体冲击式微生物气溶胶采样 器：采样流量7L/min～ 15L/min，对于0.5μ m以上粒子 的捕集效率应≥90%。 离心管：容积50mL。
GB/T 18204.3-2013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微 生物更改确认表
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修改 主题 序号
1 年号 名称
原内容
GB/T 18204.1-2000 公共场所空气微生物检验 方法 细菌总数测定
修改后内容
GB/T 18204.3-2013 公共场所卫生检验方法 第3部 分：空气微生物 中华人民共和国国家质量监督检 验检疫总局 中国国家标准化管 理委员会 GB/T 18204的本部分规定了公共 场所空气中细菌总数、真菌总数 、β -溶血性链球菌和嗜肺军团 菌的现场采样与实验室培养方法 。 本部分适用于公共场所空气 中细菌总数、真菌总数、β -溶 血性链球菌以及嗜肺军团菌的测 定，其他场所可参照执行。 新 增：注：本部分钟同一个指标如 果有2个或2个以上检验方法时， 可根据技术条件选择使用。
恒温培养箱
3.3
自然沉降法
3.3.1
仪器和设备
3.3.1.1 高压蒸汽灭菌器
3.3.1.2 恒温培养箱
3.3.1.3 平皿：Φ 90mm
3.3.1.4 采样支架
3.3.2
培养基 见3.2.2
3.3.3
采样
3.3.3.1 采样点：见附录A.
3.3.3.2 采样环境条件：见3.2.3.2
采样方法：将营养琼芝平板置于 3.3.3.3 采样点处，打开皿盖，暴露5min 。
5.2.3
采样 见3.2.3
5.2.4
检验步骤 培养方法：采样后的血琼脂平板 在35℃～37℃下培养24～48h。
5.2.4.1
结果观察：培养后，在血琼脂平 板上形成灰白色、表面突起、直 径0.5mm～0.7mm的细小菌落，菌 落透明或半透明，表面光滑有乳 光；镜检为革兰式阳性无芽胞球 菌，圆形或卵圆形，呈链状排 5.2.4.2 列，受培养与操作条件影响，链 的长度在4个～8个细胞至十几个 细胞之间；菌落周围有明显的 2mm～4mm界限分明、完全透明的 无色溶血环。符合上述特征的菌 落为β -溶血性链球菌。 5.2.5 结果报告
3.3.4
检测步骤 见3.2.4
3.3.5
结果报告 计数每块平板上生长 的菌落数，求出全部采样点的平 均菌落数，检验结果以每平皿菌 落数（CFU/皿）给出。
3.4
冰箱
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3.5
平皿
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3.6
制备培养基用一般设备： 量筒，三角烧瓶，pH计或 精密pH试纸等。
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3.7
撞击式空气微生物采样器
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4
培养基
3.2.4
3.2.5
结果报告
采样点细菌总数结果计算：菌落 计数，记录结果并按稀释比与采 3.2.5.1 气体积换算成CFU/m³（每立方米 空气中菌落形成单位）。 一个区域细菌总数测定结果：一 个区域空气中细菌总数的测定结 3.2.5.2 果按该区域全部采样点中细菌总 数测定值中的最大值给出。
3.3
6.3.1.2 BCYE添加剂成分
6.3.1.3 吸收液成分 制法：将活性炭、酵母浸出粉加 水至1000mL，121℃下高压灭菌 15min，加入GVPC添加剂 6.3.1.4 （6.3.1.1）和BCYE添加剂 （6.3.1.2），分装于灭菌后的 离心管（6.2.3）中备用。 6.3.2 采样吸收液2——酵母提取液
4
真菌总数
4.1
营养琼脂培养基
4.1
原理 采用撞击法或自然沉降法 采样、沙氏琼脂培养基培养技术 的方法测定公共场所空气中的真 菌总数。
4.1.1 成分
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制法 将上述各成分混合， 加热溶解，校正pH至7.4， 过滤分装，121℃20min高 压灭菌，用自然沉降法测 4.1.2 定时，倾注约15mL于灭菌 平皿内，制成营养琼脂平 板。用撞击法测定时参照 采样器使用说明制备营养 琼脂平板。
检验步骤 将采集真菌后的沙氏 琼脂培养基平皿置28℃培养，逐 日观察并于第5天记录结果。若 真菌数量过多可于第3天计数结 果，并记录培养时间。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
4.2.5
结果报告
采样点真菌总数结果计算：菌落 计数，记录结果并按稀释比与采 4.2.5.1 样体积换算成CFU/m³（每立方米 空气中菌落形成单位）。 一个区域真菌总数测定结果：一 个区域空气中真菌总数的测定结 4.2.5.2 果按该区域全部采样点中真菌总 数测定值中的最大值给出。
6.1
6.2
6.2.1
6.2.2
6.2.3
6.2.4
平皿：Φ 90mm
6.2.5
CO2培养箱：35℃～～37℃。
6.2.6
紫外灯：波长360nm±2nm。
6.2.7
涡旋振荡器。
6.2.8
普通光学显微镜、荧光显微镜。
6.2.9
水浴箱。
6.3
试剂和培养基
6.3.1
采样吸收液1——GVPC液体培养 基
6.3.1.1 GVPC添加剂成分
3
仪器和设备
3
新增：细菌总数
3.1
高压蒸汽灭菌器
3.1
新增：原理 采用撞击法或自然 沉降法采样、营养琼脂培养基培 养技术的方法测定公共场所空气 中的细菌总数。
3.2
干热灭菌器
3.2
新增：撞击法
3.2.1
仪器和设备
3.2.1.1 六级筛孔撞击式微生物采样器
3.2.1.2 高压蒸汽灭菌器
3.2.1.3 恒温培养箱
发布机构 国家质量技术监督局
1
本标准规定了公共场所空 气中细菌总数的测定方法 本标准适用于公共卫生场 所空气细菌总数测定。
1
2
定义：本标准采用下列定 义 撞击法：采用撞击式空气 微生物采样器采样，通过 抽气动力作用，使空气通 过狭缝或小孔而产生高速 气流，从而使悬浮在空气 中的带菌离子撞击到营养 琼脂平板上，经37℃，48h 培养后，计算每立方米空 气中所含的细菌菌落数的 采样测定方法。
3.2.1.4 平皿：Φ 90mm
3.2.2
培养基
3.2.2.1 营养琼脂培养基成分
制法：将蛋白胨、氯化钠、肉膏 溶于蒸馏水中，校正pH为7.2～ 3.2.2.2 7.6，加入琼脂，121℃，20min 灭菌备用。
3.2.3
采样
3.2.3.1 采样点：见附录A
采样环境条件：采样时关闭门窗 3.2.3.2 15min～30min，记录室内人员数 量、温湿度与天气状况等， 采样方法：以无菌操作，使用撞 击式微生物采样器（3.2.1.1） 3.2.3.3 以28.3L/min流量采集5min～ 15min。采样器使用按照说明书 要求进行。 检验步骤 将采集细菌后的营养 琼脂平皿置35℃～37℃培养 48h，菌落计数。
6.4.2
6.4.3
6.4.4
6.4.5
6.4.6 6.5
6.5.1
6.5.2
6.5.3
6.5.4
将采样吸收液1（6.3.1）20mL倒 入微生物气溶胶采样器 （6.2.2）中，然后用吸管加入 矿物油1滴～2滴。 将微生物气溶胶浓缩器 （6.2.1）与微生物气溶胶采样 器（6.2.2）连接，按照微生物 气溶胶浓缩器和微生物气溶胶采 样器的流量要求调整主流量和浓 缩流量。 按浓缩器和采样器说明书操作， 每个气溶胶样品采集空气量1m³ ～2m³。 将采样吸收液2（6.3.2）20mL倒 入微生物气溶胶采样器 （6.2.2）中，然后用吸管加入 矿物油1滴～2滴；在相同采样点 重复6.4.3、6.4.4步骤。 采集的样品不必冷冻，但要避光 和防止受热，4h内送实验室检验 。 检验步骤 样品的酸处理：对采样后的吸收 液1（6.3.1）和吸收液2 （6.3.2）原液各取1mL，分别加 入盐酸氯化钾溶液（6.3.3）充 分混合，调pH值2.2，静置15min 。 样品的接种：在酸处理后的两种 样品（6.5.1）中分别加入 1mol/L氢氧化钾溶液，中和至pH 为6.9，各取悬液0.2mL～0.3mL 分别接种GVPC平板（6.3.4）。 样品的培养：将接种平板静置于 浓度为5%、温度为35℃～37℃的 CO2培养箱（6.2.5）中，孵育 10d。 菌落观察：从孵育第3天开始观 察菌落。军团菌的菌落颜色多 样，通常呈白色、灰色、蓝色或 紫色，也能深褐色、灰绿色、深 红色；菌落整齐，表面光滑，呈 典型毛玻璃状，在紫外灯下，部 分菌落有荧光。
5.2.2
培养基
5.2.2.1 血琼脂平板成分
制法：将蛋白胨、氯化钠、肉膏 加热溶化于蒸馏水中，校正pH为 7.4～7.6，加入琼脂，121℃， 5.2.2.2 20min灭菌。待冷却至50℃左 右，以无菌操作加入脱纤维羊 血，摇匀倾皿。 计数每块平板上生长的菌 落数，求出全部采样点的 5.2.3 平均菌落数。以每平皿菌 落数（cfu/皿）报告结果 。
2.2
新增：真菌总数 公共产所空气 中采集的样品，计数在沙氏琼脂 培养基上经28℃、5d培养所形成 的菌落数。
2.3
新增：β -溶血性链球菌 公共场 所空气中采集的样品，经35℃～ 37℃、24h～48h培养，在血琼脂 平板上形成的典型菌落。 新增：嗜肺军团菌 样品经培养 在GVPC琼脂平板上生成典型菌 落，并在BCYE琼脂平板上生长而 在L-半胱氨酸缺失的BCYE琼脂平 板不生长，进一步经生化实验和 血清学实验鉴定确认的菌落。