基因工程的基本操作程序

不同点 编码区是 连续 的 _____
真核细胞
编码区是间隔的、 不连续 _____的
编码区和具 都由能够编码蛋白质的______ 相同点 有调控作用的非编码 ______区组成的
基因工程的基本操作程序
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
基因操作的基本步骤
三、将目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、 酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
1、将目的基因导入植物细胞 特点: （1）农杆菌 转化法
能感染双子叶植物和祼子植物,对 单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T—DNA可转移至受体细 胞并整合到其染色体上
3、将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程：
Ca2+处理
大肠杆菌
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态细 胞吸收 DNA
1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作 B 为受体细胞，原因是 A．结构简单、操作方便 B．繁殖速度快 C．遗传物质含量少、简单 D．性状稳定、变异少 D 2、基因工程常用的受体细胞有 ①大肠杆菌 ②枯草杆菌 ③支原体 ④动植物细胞 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．①②④
二、基因表达载体的构建——核心 1.过程:
（1）用一定的_________ 限制酶 切 割质粒，使其出现一个切口， 黏性末端 露出____________ 。 （2）用同一种限制酶 ___________切断目 的基因，使其产生相同 _____ 的黏性末端 ____________。
切口 （3）将切下的目的基因片段插入质粒的______ DNA连接酶 ，形成了一个重组 处，再加入适量___________ DNA分子（重组质粒）
1.过程:
质粒
目的基因
同种 限制酶处理
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得目的基因
表 DNA连接酶 达 载 体
2、基因表达载体的作用
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用
思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可
以完成任务吗？为什么？
不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用， 还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的主要理由是：
3、目的基因主要是指_______________ 的结构基因。 编码蛋白质 获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中 核苷酸 序列，基因在 获取目的基因，根据基因的_________ 染色体 上的位置，基因的________ 转录 产物mRNA，基 ________ 因的_______ 表达 产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用 PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在________ 体外 完 成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的 ________ 核苷酸 序列，以便于合成_________ 引物 。（3）如果基 因较小且核苷酸序列已知，可以通过____________ 人工合成 方 法。
（2）利用PCR技术扩增目的基因
PCR——聚合酶链式反应
是一项生物体外复制特定DNA片 段的核酸合成技术。通过此技术，可 获取大量的目的基因。
PCR技术
• 原理： DNA复制 • 前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料
模板DNA；DNA引物；四种脱氧 核苷酸；热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）；离子
（3） 人工合成
——根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列 推测 结构基因的核苷酸序列 化学合成 目的基因
1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最 方便方法是 A A、化学合成法 B、基因组文库法 C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应 2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 ①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术 扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利 D 用化学方法人工合成 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③
(四)目的基因的检测与鉴定 ①导入检测：目的基因是否导入受体细胞 方法—— DNA分子杂交 分 检测 转录检测——分子杂交 子 检 ②表达检测 测 翻译检测——抗原抗体杂交 法 抗虫鉴定 鉴定 抗病鉴定
个体水平的鉴定
活性鉴定等
1、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA 分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可 用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 D ①双链DNA分子为模板 ②ATGTG或TACAC模板链 ③四种脱氧核苷酸 ④四种核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥热 稳定DNA聚合酶⑦引物 ⑧温度变化 ⑨恒温 A．①③④⑦⑨ B．①④⑥⑦⑧ C．②⑤⑥⑦⑨ D．①③⑥⑦⑧ 2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧 核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA 扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱 B 氧核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个
基因组文库:
基因文库中包含了一种生物所有的基 因,这种基因文库叫做基因组文库.
部分基因文库:
基因文库中包含了一种生物的一部分 基因,这种基因文库叫做部分基因文库.
基因组文 库与部分 基因文库 的关系
思考：基因文库如何构建？
如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的 多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一 个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就构成了这种生物的 cDNA文库。这种方法称——反转录法
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因 的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码 序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其 他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么 部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基 因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基 因借助花粉管通道进入受体细胞。
2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射技术 操作程序:
提纯含目的基 因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物
3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在 基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合 C C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达
4. 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因 的做法正确的是 C ①将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 ②将编码毒素蛋白 的DNA序列注射到棉受精卵中 ③将编码毒素蛋白的 DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精 卵中 ④将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入 细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 A．①② B．②③ C．③④ D．①④ 5. 下列属于基因工程中导入目的基因方法的是 C ①农杆菌转化法 ②基因枪法 ③花粉管道法 ④显微注 射法 ⑤胚胎移植 ⑥DNA分子杂交法 A．①②③④⑤⑥ B．①②③④⑤ C．①②③④ D．①③④⑤⑥
3.基因表达载体的组成：
a、目的基因
b、启动子 c、终止子 位于基因的首端,是 mRNA结合位点 位于基因的末端,终 止转录
d、标记基因 检测目的基因是否导入受体细胞
它们有什么作用？
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因 2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起 始密码 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对 mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因 从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同 而有所差别 C 3、目前转基因工程可以 A. 打破地理隔离但不能突破生殖隔离 B. 打破生殖隔离但不能突破地理隔离 C. 完全突破地理隔离和生殖隔离 D. 部分突破地理隔离和生殖隔离
一、目的基因的获取——
将需要的基因从供体生物 的细胞内提取出来。 目前被较广泛提取 使用的目的基因有：苏 云金杆菌抗虫基因、人 胰岛素基因、人干扰素 基因、种子贮藏蛋白基 因、植物抗病基因等。
供体生物细胞
取出DNA
用限制酶剪 去多余部分
限制酶
目的基因
一、目的基因的获取
编码蛋白质的结构基因 1、目的基因主要是指______________________ 请举出三个以上的例子 2、获取目的基因的常用方法 （1）从基因文库中获取
（2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成
(1)从基因文库中获取目的基因
什么是基因文库？ 什么是基因组文库？ 什么是部分基因文库？
怎样从基因文库中得到我们所需的目 的基因？
目的基因的有关信息与什么相联系？
概念：基因文库 （gene library） 部分基因文库（如cDNA文库）
基因组文库
将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌 分别含有这种生物的不同的基因,称为基因 文库(gene library)
• 方式：以_____ 指数 方式扩增， PCR扩增仪 2n （n为扩增循环的次数） 即____

过程 变性、退火、延伸三步曲
变性：加热至90～95℃ 双链DNA解链成为单链 DNA 退火：冷却至55～60℃ 变性 部分引物与模板的单链 DNA的特定互补部位相配 对和结合 延伸：加热至70～75℃ 以目的基因为模板，合 成互补的新DNA链 退火 延伸
编码区 非编码区
编码区上游
启动子
编码区下游
终止子
与RNA聚合酶 结合位点
外显子 真核 细胞 的 基因 结构 编码区
内含子
外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列 非编码区 ：有调控作用,上游有启动子，下 游有终止子
非编码序列： 包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞
原核细胞的基因结构(补充内容） 非编码区 编码区上游 启动子 编码区 非编码区 编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
原核 细胞 的 基因 结构 编码区 ：编码蛋白质 ,连续不间断 ①不编码蛋白质。
非编码区 ②调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子
真核细胞的基因结构（补充内容）
非编码区
1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的 A、染色体DNA B、线粒体DNA A C、总mRNA D、tRNA 2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库 的描述正确的是 C A、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个 生物 体内，则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文 库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文 库
转化过程:
表 植 农 Ti质粒 构建 达 转入 插入 植物细胞 表达 新 导入 物 杆 性 染色 DNA 载 细 菌 状 目的基因 体 胞
（2）基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。
（3）花粉通道法
cDNA文库的构建
②反转录法：
mRNA
反转录 cDNA (互补DNA） DNA聚合酶
mRNA 反转录酶
cDNA
基因重组
双链DNA
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
基因组DNA文库
cDNA文库
（3）如何从基因文库中得到所需要的基因？ 依据：目的基因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。