增生期和成熟期皮肤瘢痕中的神经纤维形态学观察(精)

增生期和成熟期皮肤瘢痕中的神经纤维形态学观察

作者：李霞作者单位：山东大学附属省立医院烧伤整形科，济南 250021

【摘要】目的观察不同时期增生性瘢痕(HS)中神经纤维数量和形态的变化。方法标本取自烧伤或创伤后HS形成1月～23年的患者，分为增生期瘢痕

组(≤6月)和成熟期瘢痕组(>6月)，正常对照组取自患者的供皮区。利用单克

隆抗神经丝蛋白(NF)抗体免疫荧光染色技术，在荧光显微镜和激光扫描共聚焦

显微镜(LSCM)下观察不同时期瘢痕组织和正常皮肤组织中神经纤维的差异。结

果增生期瘢痕组神经纤维的阳性面积比明显高于正常对照组(P<0.05)，神经纤维分布杂乱，形态不规整，有局部的扭曲变细和肿胀断裂;成熟期瘢痕组神经纤维的阳性面积比明显低于正常对照组(P<0.05)，神经纤维排列较规整，内部结

构和立体结构均接近正常。结论瘢痕增生过程中神经纤维的密度和形态皆随时间变化而变化。

【关键词】瘢痕肥大性神经微丝蛋白质类神经支配神经再生

(1. Department of Plastic Surgery, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China;

2. Shandong Medical College, Jinan 250002, China)

To observe the changes of number and morphology of nerve fibers

in different periods of hypertrophic scar(HS). Methods Samples were obtained from post burn or post traumatic(1 months23 years) patients and divided into two groups: the proliferative HS group (six months). The control samples were taken from donor sites of patients. Immunofluorescent staining technique with anti neurofilament(NF) monoclonal antibody was employed to determine the expression of NF in scars and normal skin. The morphology of nerve fibers in hypertrophic scars and normal skin was investigated with a light microscope and a laser scanning confocal microscope (LSCM). Results The positive area ratio of nerve fibers was much higher in the proliferative HS group than in the control group(P<0.05), and the nerve fiber was in an irregular shape and had a disordered distribution with local swelling, twisting and disconnection. However, the positive area ratio of nerve fibers was much lower in the mature HS group than in the control

group(P<0.05), and the nerve fiber was orderly arranged with the continuance of inner structure and stereoscopic structure similar to normal skin. Conclusion Innervation in HS gradually changes with scarring maturation, and nerve fibers may play roles in scar

formation related to the morphologic changes.

Key words: Cicatrix, hypertrophic; Neurofilament proteins; Innervation; Nerve regeneration 实验证实[1]，神经因素在增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)的形成中发挥重要作用。为了研究不同时期HS的神经构筑，本实验采用免疫荧光技术对HS中神经纤维染色，用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)分别观察神经纤维的二维和三维空间结构。

神经丝蛋白(neurofilament, NF)对神经纤维染色的特异性高，而且较其他神经标记物能更有效地反映神经纤维损伤与修复的动态过程。本研究采用先进的LSCM技术，能对组织细胞进行分层扫描，逐层获取二维光学图像，然后对光学切片进行三维重建显示组织细胞的立体结构，更详细地观察神经纤维形态学的变化，从而为研究瘢痕组织中的神经支配提供形态学依据。

1 资料与方法

1.1 主要试剂和器材恒温冰冻切片机(Leica CM 1850,德国);荧光显微镜(Leica DMIRE 2, Leica IM 50 系统,德国);LSCM(Zeiss LSCM 510型, LSCM 510 software version

2.5 系统,德国);单克隆鼠抗人NF抗体(ABCAM公

司,UK,1∶500);异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗鼠IgG(SBA公司,德国，1∶250);缓冲甘油(0.5?mol/L pH 9.0的碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合)。

1.2 标本来源及分组 HS共30例，取自创伤愈合后1个月～23年来山东大学附属省立医院行瘢痕整复手术的患者。选取实验对象的标准：瘢痕明显高出皮肤，色红，质韧，瘢痕增生局限于皮损区，表面无破溃及感染，可见毛细血管扩张，伴或不伴瘙痒疼痛症状，局部未行任何治疗。取材前确认患者无皮肤病或其他慢性病史，肝功、生化等实验室检查结果皆正常。以6个月为界将实验对象分为增生期瘢痕组(≤6月)和成熟期瘢痕组(>6个月)，每组15例。从以上患者的供皮区切取全层皮肤作为正常对照组(n=10)。实验前征得患者及监护人同意。

1.3 标本处理标本均切成0.5?cm×0.5?cm～1.0?cm×1.0?cm大小的全层组织块，放入标本袋中并做好标记，放于液氮罐口处，当组织块接触液氮开始气化沸腾时，使组织块保持原位，组织即由底部向表面迅速冷冻形成冻块，然后置入液氮罐中冷冻保存。实验时将组织块放入恒温冰冻切片机做冰冻切片，切片垂直于皮肤表面。每个组织块切2套切片：一套10?μm厚行免疫荧光染色、荧光显微镜观测;一套30?μm厚行免疫荧光染色、LSCM观测。每组皆设阴性对照。

1.4 抗体准备与组织化学染色将一抗和荧光二抗原液在推荐工作浓度内，通过抗体滴度实验确定最佳浓度。10?μm切片放入4?℃纯丙酮中固定10?min，3%H2O2室温孵育10?min，PBS冲洗5?min/次×3次，10%山羊血清室温孵育20?min，倾去血清、勿洗，滴加50～100?μL的稀释一抗(1∶500)于湿盒中4?℃过夜，PBS冲洗5?min/次×3次，捞出玻片并吸干多余水份，滴加稀释二抗(1∶250)于37?℃温箱中避光孵育30?min，PBS冲洗5?min/次×3次，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。30?μm切片染色步骤同上，只是一抗和二