实验蛋白质含量测定
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生物化学与分子生物学基础实验
图1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱 图A是15μg /ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白 IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明胶(G)的吸收光谱，缓冲液为：0.01% Brij35,0.1M K2SO4,5mM KH2PO4,pH7。 图B是10μg /ml RNA和DNA的吸收 光谱。
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
优点： • 不需添加任何试剂，因而对样品没有任何
破坏； • 测量极其简单迅速； • 蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。 • 适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白
质。
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
缺点：
• 干扰测定的影响因素多，尤其是RNA和DNA在此波 长均有强吸收, 所以一定要考虑样品中是否有核酸. 要得到准确可靠的结果，必须严格控制样品溶液的 pH和化学组成，使待测样品和标准样品的实验条件 一致。
A595
室温放置5分钟后测595nm的光吸。
考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇 洗涤后，用双蒸水清洗。
注意混匀，但不要剧生烈物化震学与荡分子。生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
原理：Folin-酚试剂法的显色试剂由试剂甲和试剂乙 组成。 试剂甲中的Cu2+碱性条件下与肽键形成络合物并被还原 成Cu+。 Cu+以及蛋白质中的Tyr等的侧链基团与试剂乙反应， 试 剂 乙 中 的 磷 钼 酸 盐 — 磷 钨 酸 盐 被 蛋 白 质 中 的 Tyr 和 Phe残基还原，产生蓝色化合物（钼兰和钨兰的混合 物），显色反应在30分钟内接近极限。 颜色深浅与蛋白含量成正比，可在640nm下测光吸收。
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
肽键在190nm有强吸收峰。 一般分光光度计在190nm的光强较弱，且O2在 此波长有吸收，因此通常使用205nm或210nm 波长，Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met, and Arg的 侧链在此波长有吸收。优点：灵敏，较稳定。 缺点: 干扰因素多。许多化学物质特别是含C ＝C双键和C＝O双键的物质在此波长范围有 吸收，所以必须严格控制反应条件。
蓝G250
生物化学与分子生物学基础实验
考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
实验操作步骤
管号
01 2 3 4 5 6 7
标准蛋白 ul 0 10 20 40 60 80 100 0
蒸馏水 ul
100 90 80 60 40 20 0 0
待测蛋白 ul
--
-
-
-
来自百度文库
-
- 100
Bradford 试剂 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml
①有多少样品可供分析; ②蛋白质样品浓度大约是多少; ③样品中含有哪些可能影响定量的化学物质； ④所选方法是否简单、可靠； ⑤含量测定的专一性要求是否很高。
生物化学与分子生物学基础实验
常用的方法
物理性质：紫外吸收法 化学性质：Folin－酚试剂法（Lowry法），BCA法
（Bicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲 法（Biuret法），胶体金测定法，等等 染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、银染 法
测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量 为16％）。
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有两个 强烈吸收峰：280nm和190nm。
280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这些 光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸(Trp)、和 酪氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收280nm波长的光子， 苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）也有微弱吸收。 蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关， 因此相同浓度的不同种类蛋白质，其280nm的吸收 值差别很大(图1)。
5
6
7
3.0 4.0 0
1.0 0
0
蛋白质含量
0
(mg/ml)
0.25 0.375 0.5 0 .6 2 0.7 1.0
5
5
未知蛋白溶 液（ml）
-
-
-
-
-
-
-
4.0
A280
生物化学与分子生物学基础实验
考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
原 理 ： 该 方 法 由 Bradford 于 1976年建立。在酸性条件下， 考马斯亮蓝与蛋白质结合后最 大 光 吸 收 波 长 由 4 6 5 nm（ 红 色 ） 转 移 为 5 9 5 nm（ 蓝 色 ） ， 起 作 用 的 主 要 氨 基 酸 是 Arg， 另 外 ， His, Lys, Tyr, Trp 和 Phe 也 有作用。
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
• 酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙 醇、DTT、苯酚等）干扰本反应。
• 不同蛋白质主要因其所含的Tyr含量不同而呈现不同的吸收强度。 • 进行测定时，加试剂乙时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH
条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当试 剂乙加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在 磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。这一步 混合速度要快，否则会使显色程度减弱。 • 因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控 制时间。 • 费时较长，试剂配制较繁琐。
实验一 几种蛋白质定量测
定方法的比较
生物化学与分子生物学基础实验
实验目的
1 掌握紫外吸收法、Folin－酚试剂法 （Lowry法）和考马斯亮蓝染色法 （Bradford法）测定蛋白质含量的原 理和方法
2 掌握分光光度计的原理和使用方法
生物化学与分子生物学基础实验
选择合适的蛋白质含量测定方法主要 基于几点考虑：
• 敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。
• 用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准 蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差 较大。
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
操作步骤
管号
0
标准蛋白溶
0
液（ml）
双蒸水（ml） 4.0
1
2
1.0 1.5
3.0 2.5
3
4
2.0 2.5
2.0 1.5
2 － 5 min 呈 最 大 光 吸 收 ， 至 少 可稳定1小时
生物化学与分子生物学基础实验
考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
简便, 迅速，灵敏度较高。只需要一种反应 试剂
影响因素较少。去污剂和两性物质对测定有 干扰
小于3000Da 的多肽无法测定 蛋白浓度高时非线性 配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮
图1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱 图A是15μg /ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白 IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明胶(G)的吸收光谱，缓冲液为：0.01% Brij35,0.1M K2SO4,5mM KH2PO4,pH7。 图B是10μg /ml RNA和DNA的吸收 光谱。
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
优点： • 不需添加任何试剂，因而对样品没有任何
破坏； • 测量极其简单迅速； • 蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。 • 适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白
质。
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
缺点：
• 干扰测定的影响因素多，尤其是RNA和DNA在此波 长均有强吸收, 所以一定要考虑样品中是否有核酸. 要得到准确可靠的结果，必须严格控制样品溶液的 pH和化学组成，使待测样品和标准样品的实验条件 一致。
A595
室温放置5分钟后测595nm的光吸。
考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇 洗涤后，用双蒸水清洗。
注意混匀，但不要剧生烈物化震学与荡分子。生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
原理：Folin-酚试剂法的显色试剂由试剂甲和试剂乙 组成。 试剂甲中的Cu2+碱性条件下与肽键形成络合物并被还原 成Cu+。 Cu+以及蛋白质中的Tyr等的侧链基团与试剂乙反应， 试 剂 乙 中 的 磷 钼 酸 盐 — 磷 钨 酸 盐 被 蛋 白 质 中 的 Tyr 和 Phe残基还原，产生蓝色化合物（钼兰和钨兰的混合 物），显色反应在30分钟内接近极限。 颜色深浅与蛋白含量成正比，可在640nm下测光吸收。
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
肽键在190nm有强吸收峰。 一般分光光度计在190nm的光强较弱，且O2在 此波长有吸收，因此通常使用205nm或210nm 波长，Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met, and Arg的 侧链在此波长有吸收。优点：灵敏，较稳定。 缺点: 干扰因素多。许多化学物质特别是含C ＝C双键和C＝O双键的物质在此波长范围有 吸收，所以必须严格控制反应条件。
蓝G250
生物化学与分子生物学基础实验
考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
实验操作步骤
管号
01 2 3 4 5 6 7
标准蛋白 ul 0 10 20 40 60 80 100 0
蒸馏水 ul
100 90 80 60 40 20 0 0
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Bradford 试剂 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml
①有多少样品可供分析; ②蛋白质样品浓度大约是多少; ③样品中含有哪些可能影响定量的化学物质； ④所选方法是否简单、可靠； ⑤含量测定的专一性要求是否很高。
生物化学与分子生物学基础实验
常用的方法
物理性质：紫外吸收法 化学性质：Folin－酚试剂法（Lowry法），BCA法
（Bicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲 法（Biuret法），胶体金测定法，等等 染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、银染 法
测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量 为16％）。
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有两个 强烈吸收峰：280nm和190nm。
280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这些 光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸(Trp)、和 酪氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收280nm波长的光子， 苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）也有微弱吸收。 蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关， 因此相同浓度的不同种类蛋白质，其280nm的吸收 值差别很大(图1)。
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未知蛋白溶 液（ml）
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生物化学与分子生物学基础实验
考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
原 理 ： 该 方 法 由 Bradford 于 1976年建立。在酸性条件下， 考马斯亮蓝与蛋白质结合后最 大 光 吸 收 波 长 由 4 6 5 nm（ 红 色 ） 转 移 为 5 9 5 nm（ 蓝 色 ） ， 起 作 用 的 主 要 氨 基 酸 是 Arg， 另 外 ， His, Lys, Tyr, Trp 和 Phe 也 有作用。
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
• 酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙 醇、DTT、苯酚等）干扰本反应。
• 不同蛋白质主要因其所含的Tyr含量不同而呈现不同的吸收强度。 • 进行测定时，加试剂乙时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH
条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当试 剂乙加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在 磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。这一步 混合速度要快，否则会使显色程度减弱。 • 因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控 制时间。 • 费时较长，试剂配制较繁琐。
实验一 几种蛋白质定量测
定方法的比较
生物化学与分子生物学基础实验
实验目的
1 掌握紫外吸收法、Folin－酚试剂法 （Lowry法）和考马斯亮蓝染色法 （Bradford法）测定蛋白质含量的原 理和方法
2 掌握分光光度计的原理和使用方法
生物化学与分子生物学基础实验
选择合适的蛋白质含量测定方法主要 基于几点考虑：
• 敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。
• 用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准 蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差 较大。
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
操作步骤
管号
0
标准蛋白溶
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液（ml）
双蒸水（ml） 4.0
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2.0 1.5
2 － 5 min 呈 最 大 光 吸 收 ， 至 少 可稳定1小时
生物化学与分子生物学基础实验
考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
简便, 迅速，灵敏度较高。只需要一种反应 试剂
影响因素较少。去污剂和两性物质对测定有 干扰
小于3000Da 的多肽无法测定 蛋白浓度高时非线性 配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮