分子诊断项目

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流式细胞仪的检测范围
细胞结构
细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量
细胞功能
细胞表面/胞浆/核的 特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体
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散射光信号
Right Angle Light Detector α Cell Complexity
分子诊断室项目介绍
内容
1.HBV-DNA荧光定量 荧光定量PCR 荧光定量 2.流式基本应用 流式基本应用 3.染色体核型分析 染色体核型分析
HBV DNA荧光定量PCR
PCR技术简介
1985年美国 年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室 年美国 公司的人类遗传研究室 mullis等人发明了具有划时代意义的 等人发明了具有划时代意义的PCR技术， 技术， 等人发明了具有划时代意义的 技术 从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望 成为现实。 成为现实。 1988年PE-cetus公司推出了第一台 公司推出了第一台PCR热循环仪， 热循环仪， 年 公司推出了第一台 热循环仪 从而使PCR技术的自动化成为现实。 技术的自动化成为现实。 从而使 技术的自动化成为现实 Mullis出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变 出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变 的发明者Michael分享了 分享了1993年诺贝尔化学奖。 年诺贝尔化学奖。 的发明者 分享了 年诺贝尔化学奖 随着PCR技术的日臻成熟 技术的日臻成熟1995年出现荧光基因探针 年出现荧光基因探针 随着 技术的日臻成熟 年出现 杂交定量PCR方法 杂交定量 方法
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Ct值与起始模板的关系 Ct值与起始模板的关系
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 Ct 对数存在线性关系，起始模板数越多， 对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct 值越小， 值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作 出标准曲线，只要获得未知样品的Ct Ct值 出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值， 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷 贝数。 贝数。
常规 PCR 2 步法 3 步法 dNTP，引物，模板， 酶 琼脂糖凝胶电泳 定性 无法区别假阴性、假阳 性
定量 PCR 2 步法 3 步法 dNTP，引物，模板， 酶，探针，参照 ELISA，或实时荧光检测 定量，或定性 有效识别假阴性假阳性
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实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR原理 PCR
SSC
Incident Light Source Forward Light Detector α Cell Surface Area
FSC
= 前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 前向角散射光（FSC, Scatter）
细胞相对大小及其表面积
= 侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 侧向角散射光（SSC, Scatter）
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流式基本应用
流式细胞术的概念
流式细胞术（ 简称FCM FCM） 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快 准确、客观， 速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态 中的单个微粒（通常是细胞）的多项特性， 中的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量 的技术， 的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成 微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征
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注意事项
每天实验前， 在废物缸内套上塑料袋， 4. 每天实验前 ， 在废物缸内套上塑料袋 ， 加入半缸含有效氯1 次氯酸钠液， 加入半缸含有效氯 1% 次氯酸钠液 ， 实验时 将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。 将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。 所有试剂试验前充分融化， 5. 所有试剂试验前充分融化 ， 避免反复冻 融。 每次PCR反应均应设立阴阳性对照。 PCR反应均应设立阴阳性对照 6.每次PCR反应均应设立阴阳性对照。
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定量PCR在乙肝检测中意义 定量PCR在乙肝检测中意义 PCR
1. 2. 3. 4. 5. 6. 判断疾病的严重程度和传染性 PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 观察抗病毒药物疗效， 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 预测病情、 预测病情、判断预后 器官移植、 器官移植、母婴垂直传播
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标本留取及检测步骤
标本：静脉血3ml，黄色盖试管。标本避免 溶血和脂血。 检测步骤：1.反应液配制 2.核酸提取 3.核酸扩增 结果分析：采用样点拟合法，由标准曲线 得到病毒的拷贝或IU/ML。
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注意事项
分区操作：PCR具有超敏感性 具有超敏感性， 1.分区操作：PCR具有超敏感性，因此在检 测过程中应分区操作， 即分为试剂准备区， 测过程中应分区操作 ， 即分为试剂准备区 ， 样品处理区，PCR扩增区 扩增区。 样品处理区，PCR扩增区。 试验前实验室应使用紫外消毒至少30 30分 2. 试验前实验室应使用紫外消毒至少 30 分 钟。 3. 操作时戴一次性手套， 加样头要求及时 操作时戴一次性手套 ， 更换，吸液时避免飞溅。 更换，吸液时避免飞溅。
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PCR基本原理
类似DNA的体内复制，以单链DNA为模板， 利用DNA聚合酶依赖于模板的特性，在附 加的一对寡核苷酸引物之间催化合成互补 链的过程。
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DNA 合成的必备要素
DNA Polymerase dNTPs single-stranded template primer
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定量PCR概念 定量PCR概念 PCR
以外参或内参为标准， 以外参或内参为标准，通过对 PCR终产物的分析或PCR过程的 终产物的分析或PCR PCR终产物的分析或PCR过程的 监测， PCR起始模板量的定量 监测，对PCR起始模板量的定量
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常规PCR与定量PCR的比较 常规PCR与定量PCR的比较 PCR与定量PCR
反应方式 反应液成分 结果检测 结果性质 结果准确性
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Taqman探针原理
当溶液中模板 变 性后低温退火时， 性后低温退火时 ， 引物与探针同 时 与模板结合 。 在 引物的介导下 ， Taq酶沿模板向前 酶 合成子链 ， 当 延 伸至探针结合处， 伸至探针结合处 ， 发生链的置换； 发生链的置换；
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Taqman探针原理
Taq 酶 的 的5‘—3’ 外切酶活 性 将探针5‘端连接的荧光基团 将探针 端连接的荧光基团 从探针上切割下来， 从探针上切割下来，游离于 反应体系中，从而脱离3’端 反应体系中，从而脱离 端 荧光淬灭基团的屏蔽， 荧光淬灭基团的屏蔽，发出 荧 光 ， 荧 光 信 号 与 PCR 产 物的数量成比例。 物的数量成比例。因此根据 PCR 反 应 液 的 荧 光 强 度 即 可计算出初始模板的数量。 可计算出初始模板的数量。
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淋巴细胞亚群分析
使用经荧光素标记的特异单克隆抗体， 使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进 行多色染色， 行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种 白细胞分化抗原（CD分子 的表达， 分子） 白细胞分化抗原（CD分子）的表达，可以 将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析 将淋巴细胞亚群区分开， 各淋巴细胞亚群的百分含量 淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析 淋巴细胞亚群的绝对计数，
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ִ根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为 根据CD4、CD8表达， 根据CD4 表达 ִT辅助/诱导细胞（CD3+CD4+），即 Th/Ti ），即 T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+）， ִT抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）,即 Ts/Tc T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+） ִTh/Ts比值 可用于评价自身免疫失调、被怀 Th/Ts比值 可用于评价自身免疫失调、 Th/Ts 疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免 疫状态
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ＰＣＲ与乙肝标志物阳性率比较
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例数 HBsAg HBcIgG HBcIgM HBeAg HBeAb HBsAb PCR 阳性率(％) ──────────────────────────────────── ８６ ＋ ３４ ３９.５３ ４５ ＋ ＋ １９ ４２.２２ ４２ ＋ ５ １１.９０ ２８ ＋ ＋ ＋ ２７ ９６.４３ ２９ ＋ ＋ ＋ ２９ １００ １０ ＋ ＋ １０ １００ ２８ ＋ １ ３.５７ ３７ ＋ ＋ ３ ８.１１ １０ ＋ ０ ０ １０ ＋ ＋ ０ ０ ────────────────────────────────────
指在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号 指在 反应体系中加入荧光基团 的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对 进程， 的积累实时监测 进程 未知模板进行定量分析。 Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧 值定义： （ 值定义 光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 荧光阈值（ 的缺省设置是3-15个循 荧光阈值（threshold)的缺省设置是 的缺省设置是 个循 环的荧光信号的标准偏差的10倍 环的荧光信号的标准偏差的 倍，即： threshold=10×SD cycle0-15 ×
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根据功能， 根据功能，淋巴细胞主要分为
ִB淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 ）， ִT淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关 ），与细胞免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），
⌧ຫໍສະໝຸດ BaiduT和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性 总 和总B 疾病
ִNK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能， NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能， ），行使免疫监控功能 NK细胞 能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细 胞毒性作用。 胞毒性作用。
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Taqman探针原理
探针的5'端标记一个荧光基 探针的 端标记一个荧光基 标记另一个荧光基团。 团，3'标记另一个荧光基团。 标记另一个荧光基团 5'端荧光基团吸收能量后将 端荧光基团吸收能量后将 能量转移给临近的3’端荧光 能量转移给临近的 端荧光 淬灭基团（ ），正常 淬灭基团（FRET），正常 ）， 情况下检测不到该探针5'端 情况下检测不到该探针 端 荧光基团发出的荧光信号。 荧光基团发出的荧光信号。
细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性
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外周全血细胞散射光双参数点图 外周全血细胞散射光双参数点图 参数
（红细胞溶解后） 红细胞溶解后）
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荧光信号
使用荧光标记的单克隆抗体染色， 使用荧光标记的单克隆抗体染色，做 多色分析 荧光信号的强弱， 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的 表达含量
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数据分析
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荧光定量的标准曲线
Target
log (F2/F1)
未知标本
n
标准曲线
Crossing Point (Cycles) n log (copy number)
log (F2/F1)
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荧光检测模式
（1）SYBR Green I 染料 （2）水解探针（Taqman） （3）杂交探针（Hybridization Probes） （4）分子信标（molecular beacon) 发夹引物（sunrise primer) 蝎状引物（scorpion primer) 复合探针（complex probes)
数据显示: 数据显示: 直方图 ( Histogram )
二维点图(Dot 二维点图(Dot Plot)
等高线图(Contour 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density) 三维图（ Plot） 三维图（3D Plot）
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流式的临床应用
= = = = = = = = = = 淋巴细胞亚群分析 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的免疫状态监测 干细胞计数 阵发性血红蛋白尿 HLA-B27检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病 HIV免疫分型 CD4绝对计数 免疫分型， HIV免疫分型，CD4绝对计数