鸡卵黄抗体的制备及其不均一性

V o l .26N o.12000202

华　东　理　工　大　学　学　报

Journal of East Ch ina U niversity of Science and T echno logy

收稿日期:1999203212作者简介:杨曜中(1941～),男,江苏人,副教授,从事应用生物化学

研究。

文章编号:100623080(2000)0120053204

鸡卵黄抗体的制备及其不均一性

杨曜中,　宋聿文,　欧　伶,　范龙彬,　袁勤生

(华东理工大学生物化学系,上海200237)

摘要:介绍了免疫期卵黄液中白蛋白(牛)抗体效价和亲合力的变化。研究了pH 对稀释卵黄液去脂效果,以及硫酸铵浓度对IgY 浓缩、纯化效果的影响。探讨了抗白蛋白IgY 的异质性。实验表明稀释卵黄液酸化处理和IgY 盐析的最适合条件分别是pH 5.1和2.2m o l L 。经免疫亲和柱层析或金属(Fe 3+)螯合亲和柱层析后,白蛋白抗体样品均出现多个不同层析行为的抗体峰。实验提示免疫卵黄液中不仅可能存在不同亲合力、特异性的白蛋白抗体,还可能存在反映基本结构、理化性质差异的白蛋白抗体。

关键词:白蛋白抗体;鸡卵黄液;IgY ;免疫亲和柱层析;Fe 3+金属螯合亲和柱层析中图分类号:Q 511文献标识码:A

鸡卵黄抗体(IgY )是极具开发潜力的抗体资源[1]。国内已有不少单位正在开展鸡卵黄抗体应用的基础研究[2～6]。已经证实卵黄抗体就是由血液转移入卵黄液的IgG 类抗体。所以,专一性结合抗原

的鸡卵黄抗体可以由相应抗原免疫鸡制得。在国内的研究报导中,极大部分是以病毒、细菌、细胞等颗粒性抗原为免疫原,采用鸡腹部皮内免疫注射。一般来说,可溶性抗原(尤其是低相对分子质量可溶性抗原)的免疫原性比颗粒性抗原差,更难诱导、激活鸡免疫系统的抗体产生。本实验以牛血清白蛋白为免疫原,以福氏佐剂为免疫佐剂,对鸡背部皮下多点免疫注射后,研究免疫卵黄液中白蛋白抗体的效价和亲合力,为免疫卵黄液中可溶性抗原类目抗体的产生积累经验。实验着重探讨了pH 对稀释卵黄液去脂效果、硫酸铵盐浓度对抗体浓缩、纯化效果的影响,从而建立了一种简便而经济的卵黄抗体制备方法。从卵黄中分离得到的IgY 是一种多克隆抗体。通过免疫所得的多克隆鸡卵黄抗体(IgY )是不均一的,除含有与抗原相关不同亲合力和特异性的IgY 分子之外,尚可能含有反映IgY 基本结构上差异的IgY 分子,为进一步开展IgY 的分型研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1　主要材料与试剂

蛋鸡由闵行区种禽场提供,鸡IgG 抗血清由上海生物化学研究所张祖传研究员提供;除Sep haro se 4B 为进口分装外,其余试剂均为国产生化或分析

纯。

抗体稀释液(PB ST ):0.12m o l L 磷酸盐,0.04m o l L N aC l ,1m o l L Tw een 220,pH 7.4。1.2　分析方法

白蛋白抗体活性按文献[7]的间接酶免分析法。抗体效价(T itre )以EL ISA 值(A 492)≥0.10时的最大抗体稀释度来表示[8]。使用2m o l L M gC l 2为免疫复合物解离剂,抗体亲合力(A )以有、无2m o l L

M gC l 2存在时的抗体活性之比来表示[9]

,即A =

OD 492(2m o l L M gC l 2) OD 492(PB ST )。卵黄液中脂

质量测定按氯仿2甲醇提取法[10]。蛋白量测定按L ow ry 改良的福林2酚法[11]

,以牛血清白蛋白

(B SA )为标准蛋白。1.3　鸡的免疫

取30周龄蛋鸡,背部皮下多点免疫注射。初次免疫采用佛氏完全佐剂乳化的白蛋白(牛),以后均用佛氏不完全佐剂乳化的白蛋白(牛)。开始连续免疫3次,每2周1次,每次剂量为400Λg 。第10周中旬、第11周各加强免疫1次,每次剂量为800Λg 。鸡卵黄产生抗体的效价和亲和力见图1。1.4　鸡卵黄抗体的提取

取鸡卵黄液,用6倍去离子水搅拌下稀释,用0.1m o l L HC l 调至pH 5.1。4°C 过夜,12000r m in 、4°C 离心25m in 。除去沉淀,上清液中加入硫酸铵至2.21m o l L 饱和度,加入最终浓度为0.5g L 的

3

5

图1　鸡卵黄白蛋白抗体的表达

F ig .1　Exp ressi on of album in an tibody

in egg yo lk

N aN 3,4°C 保存备用。临用前对抗体稀释液或层析平

衡液充分透析脱盐。

1.5　亲和吸附剂的制备和亲和柱层析

B SA 2交联琼脂糖按文献[12,13]介绍的环氧氯丙烷活化法制备(略),Fe 3+螯合亲和吸附剂按H em dan ES

[14]

介绍的方法制备(略)。

免疫亲和柱层析:以第10周免疫卵黄液提取的白蛋白抗体为层析样品,上白蛋白(牛)2交联琼脂糖柱(30c m ×1.5c m ,玻璃柱)。平衡液为pH 4.5,0.1m o l L 乙酸缓冲液。洗脱液为3m o l L KCN S 。流速

0.5mL m in ,每管4mL ,分部收集,分析洗脱液蛋白量(OD 280值),结果见图2。

Fe 3+

金属螯合亲和柱层析:以第12周免疫卵黄

液提取的白蛋白抗体为层析样品,上Fe 3+2

Sep haro se 4B 柱(40c m ×1.5c m ,玻璃柱)。

平衡液为0.1m o l L pH 6.0磷酸缓冲液。洗脱液系统由分别为pH 6.0、pH 8.0的0.1m o l

L 磷酸缓冲液组成。采用线性pH 递增梯度洗脱,流速0.2mL m in ,每管

4mL 分部收集,洗脱结果见图3。Fe 3+解离液为0.05

m o l L ED TA 20.5m o l L N aC l 。

图2

　鸡卵黄白蛋白抗体的免疫亲和柱层析

F ig .2　I mm unoaffin ity co lum n ch rom atography

of an ti 2album in ch icken IgY

2　结果与讨论

2.1　鸡卵黄白蛋白抗体的产生

免疫后每周卵黄液抗体效价变化见图1,第2～6周为低效价(<1∶400)抗体,第6、14周为中等效

图3　鸡卵黄抗体的Fe 3+金属鳌合亲和柱层析

F ig .3　Fe 3+m etal 2chelated affin ity co lum n

ch rom atography of ch icken IgY

价(1∶3200～1∶6400)抗体,第7～13、14～15周为高效价(1∶6400～1∶12800)抗体。免疫后每周免疫卵黄液抗体亲合力的变化见图1,第2～4周为低亲合力(<0.7)抗体,第5、7～9、13～16周为中等亲合力(0.7～0.85)抗体,第6、9、11、12周为高亲合力的抗体。在免疫后的早期(2、3周),抗体的效价和亲合力都处于较低水平;次早期(4～6周),抗体亲合力迅速升高,效价仍处于较低水平;中、后期(7～14周),抗体亲合力稳定在较高水平,效价变化较大。

2.2　鸡卵黄白蛋白抗体的制备

2.2.1　稀释卵黄液的最适pH 收集含白蛋白抗体的卵黄液,用6倍去离子水稀释,打匀后,分成7份,用0.1m o l L HC l 分别调pH 6.6、6.0、5.4、5.1、4.8、4.6和4.4。静止过液,12000r m in 、4°C 离心25m in 肉眼观察离心后上清液的浑浊度及沉淀量。去除沉淀,通过测定上清液的脂质量和抗体活性,推算得到去脂率(%)和抗体得率,实验结果见表1。鸡卵黄中含有水(约48%)、脂类物质(磷脂、脂蛋白等)和水溶性蛋白(IgY ,鸡血清白蛋白,Α22

糖蛋白、抗生物素蛋白等)[15]。当从卵黄液中提取抗体时,首先从卵黄液中分离去脂质,再从可溶性蛋白中分离抗体。酪蛋白钠[15]、卡拉胶[16]、海藻酸钠[16]等脂质凝集剂常被用于卵黄液中脂质的去除。实验表明,当卵黄液经6倍去离子水稀释后,不需添加任何去脂剂,即可促使卵黄液中脂质的沉淀。当稀释卵黄液处于pH 6.6、pH 6.0时,分别有26.84%和79.5%的脂质转移入沉淀,离心后的稀释卵黄液呈高度浑浊状态;当

pH 5.4、

5.1、4.8、4.6时,均有92%以上的脂质转移入沉淀,但大量抗体与脂质一起转移入沉淀,pH 4.6和pH 4.4时有70%以上的抗体转移入沉淀;当pH 5.1时,脂质几乎全部转移入沉淀,肉眼观察的沉淀量也达到最大,抗体仍全部保留在卵黄液中,稀释卵黄液呈微混状态。所以,稀释卵黄液的pH 是影响脂质和抗体彼此分离的关键因素,pH 5.1是从稀释卵黄液分离抗体的最适条件。低于pH 5.1,引起抗

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