细胞凋亡

Ced3 在哺乳类同源物是 ICE（Interleukin-1 β
-converting enzyme，白介素-1β 转换酶），
即 Caspase1，可促进细胞凋亡。

常见的细胞凋亡途径有两条： Caspase 依赖性的 细胞凋亡（外源、内源性）和不依赖于 caspase 的细胞凋亡途径，两个途径一般同时被激活。

正常细胞
2、细胞凋亡 过程及特征 最重要特征：
细胞凋 亡开始
细胞质膜保
持完整，内 含物不外泄， 不引发机体 炎症反应。 需 ATP 供能
凋亡小 体被吞 噬 凋亡小 体形成
胸腺细胞凋亡过程形态变化
正常 凋亡
凋亡细胞表面发泡，许多泡状或者芽状突起，逐渐分隔，形成单 个凋亡小体。
胸腺细胞凋亡过程形态变化
② 核纤层（lamina）蛋白
核纤层解体 ③ 细胞骨架蛋白：

核纤层
导致细胞解体，
形成凋亡小体
④ 其他的 caspases
⑤ 灭活细胞凋亡的
染色体
抑制物
2、Caspase 依赖的细胞凋亡途径
分为死亡受体（Fas）起始的外源途径及线粒体起
源的内源途径两条。 1）死亡受体起始的外源途径（书上 P450） 当细胞接受凋亡信号分子（FasL，TNF 等）刺激 后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞 内衔接蛋白（Adaptor protein）结合，这些衔接蛋
（Bcl-2 homology）结构域的 C-端片段被运送到线
粒体，与 Bcl-2 / Bax 的 BH3 结构域形成复合物，
导致细胞色素 C 释放。CytC 与胞质中 Ced4 同源
物 Apaf-1（凋亡蛋白酶活化因子 apoptosis rotease
activating factor）结合并活化 Apaf-1，被活化的
第十二章
程序性细胞死亡与细胞衰老
程序性细胞死亡（PCD）
细胞衰老
第一节 程序性细胞死亡（PCD）
受到严格的基因调控、程序性的细胞死
亡形式。对生物体的正常发育、自稳态
平衡及多种病理过程具有重要的意义。
本节内容将涉及：
• 动物细胞的程序性死亡
• 植物细胞与酵母细胞的程序性死亡（自学）
动物细胞的程序性死亡
BCL-2 家族部分成员

Bax 和 Bak 寡聚化，促进 CytC 释放，引发凋亡； Bcl-2、Bcl-xL与 Bax / Bak 形成异二聚体，阻止 Bax 和 Bak 寡聚化，从而抑制凋亡。
Bcl-2 家族、线粒体与细胞凋亡
Bcl-2 家族促凋亡因子 Bid 被活化后的 Caspase8 或其他刺激因素裂解成 2 个片段，其中含有 BH3
H. Robert Horvitz John E. Sulston
秀丽隐杆线虫
C. elegans 是研究 PCD 的理想材料
卵巢
肠
咽
阴门
直肠
肛门
秀丽隐杆线虫细胞凋亡情况
幼虫细胞数（个）： 体细胞：556 原始生殖细胞：2 雄性（0.05%）细胞数： 体：1090 (cells) 生殖：1000 雌雄同体细胞数： 体：1090 –131= 959(cells) 生殖：2000
apoptosis
二、细胞坏死（necrosis） P543
细胞受到意外损伤，如极端的物理、化
学因素或与严重的病理性刺激而发生的 细胞被动死亡形式。细胞坏死时，细胞 内含物释放到胞外，引起周围区域的炎 症反应。
炎症反应
细胞凋亡与细胞坏死的特征比较
细胞坏死
性质
诱导因素 生化特点 形态变化 DNA电泳 炎症反应

通过细胞凋亡使神经元的数目与靶细胞相匹配
神经元
凋亡的神经元
靶细胞
靶细胞分泌 的存活因子 神经生长因子等
3）发育过程中手和足的成形过程
凋亡细胞被吞噬后形成趾间隔
胎
鼠
趾
的
发
育
2、凋亡的病理学意义
1）病原体侵染
诱导凋亡 — HIV
抑制凋亡 — Poxvirus（痘病毒）
2） 细胞凋亡不足
肿瘤、自身免疫疾病；
3）Caspase 的结构特征
① 起始者及执 行者均以无
活性的酶原
形式存在； ② N 端均含一 段前区域；
③ 活性形式由 2 个大亚
基和 2 个小亚基组成
的杂四聚体； ④ 在大亚基的 C 端含有 一活性中心，其中半 胱氨酸是必需氨基酸。
Active enzyme
催化位点
Caspase 的级联效应
染色体固缩，凋亡小体的形成等现象。
2、DNA Ladder 检测
1）诱导细胞的凋亡
2）收集凋亡的细胞，
染色质 DNA 在 核小体间 被切割
提取基因组 DNA
3）以 2% 的琼脂糖
胶电泳分离 DNA
4）EB 染色进行观察
3、TUNEL测定法（标记 DNA 断裂缺口的 3’-OH）
基因组 DNA 断裂时， 暴露的 3’-OH 可以在
DNA 降解成 180-200 bp 片段或其整数倍片段
4、诱导细胞凋亡的因子
1）物理性因子：

包括射线（紫外线， 射线等），较温和的温度
刺激（如：热激，冷激）等。
2）化学及生物因子：

包括活性氧基团和分子（超氧自由基，H2O2）， DNA 和蛋白质合成的抑制剂，正常生理因子 （激素、细胞生长因子）的失调及凋亡因子（肿瘤 坏死因子，TNF）、细胞毒素等。
细胞死亡的方式主要有三种： 细胞凋亡（apoptosis）
细胞坏死（necrosis）
细胞自噬（autophagy）
衰老
机体结构
细胞增殖
细胞分化
细胞凋亡
细胞信号转导
染色体
（DNA 与蛋白质的相互作用）
细胞凋亡（Apoptosis）
● 细胞凋亡一词的来源：
细胞凋亡一词，即 apoptosis，源自希腊语，
细胞凋亡内源和外源信号途径
死亡诱 导信号 复合物
接头蛋白
凋亡诱导 因子 接头蛋白
Bcl-2 家族
起始者 起始者
Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子
执行者
DD ：死亡结构域 DED ：死亡效应结构域 8，10 CARD: caspase 募集结构域 2，9
2）Bcl-2 家族与线粒体起源的内源性细胞凋亡
凋亡细胞 DNA 降解片段电荷发生了变化，在电场泳动 的速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案。
◆ 流式细胞分析（凋亡细胞为亚二倍体）
1、形态学观测
1）台盼蓝染色:

台盼蓝可为活细胞排斥，但可使死细胞着色。
2）Giemsa 染色：

可观察染色质固缩，凋亡小体的形成等。
3）透射和扫描电镜：

可观察凋亡细胞核的形态、结构变化，如：
白又募集 Procaspase 聚集在受体部位，胞质内的
Procaspase 相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡。
下游 caspases 活化后，作用于底物，裂解核
纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解
Dnase 结合蛋白，使 Dnsae 释放，降解 DNA
形成 DNA ladder，裂解参与细胞连接或附着
正常
凋亡
细胞坏死
可逆膨胀
不可逆 膨胀 解体
细胞凋亡
胞膜 完整
细胞 皱缩
破碎
3、细胞凋亡的生化特征（DNA 梯状条带）
1）细胞色素 C 诱导 0h
2）细胞色素 C 诱导 1h 3）细胞色素 C 诱导 2h
4）细胞色素 C 诱导 3h
5）细胞色素 C 诱导 4h 6）阴性对照 7）Marker
细胞色素C 作用： 促进细胞内特异性 核酸酶内切酶活化。
末端脱氧核苷酸转移
酶（TdT） 的催化下， 加上荧光或 DIG 标记 的 dUTP ，可通过荧 光显微镜 / 流式细胞仪 或酶促显色进行检测。
TUNEL 测定法检测晶状体上皮细胞的凋亡情况
4、DAPI Staining 方法（与 DNA 结合的染料）
四）细胞凋亡的分子机制

线虫（C. elegans）的凋亡研究发现： ced3、ced4 基因促进细胞凋亡，ced9 基因可阻 止ced3/ced4 的激活，抑制细胞凋亡。
本意指树叶的脱落或花瓣的凋零。
选用此词，是强调这一过程是一种自然的生
理学过程，是受基因调控的主动的生理性细
胞自杀行为。
2002年，悉尼· 布雷诺尔（英）、罗伯特· 霍维茨（美） 和约翰· 苏尔斯顿（英） ，因在器官发育的遗传调控和 细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理学/医学奖。
• Sydney Brenner
Apaf-1 再活化 Procaspase9，最后引起细胞凋亡。
执行者
起始者
凋亡蛋白酶 活化因子
CytC 被释放并 与 Apaf1 结合
细 胞 内 程源 序信 性号 死激 亡发 细 胞
死亡受体通路与线粒体通路的联系
凋亡诱导因素 死亡受体/配体的表达、结合
Bid活化 线粒体通路
活化
Caspase-8活化 Caspase-3活化
1、Caspase 家族与凋亡
1）Caspase 家族简介

Caspase 的活性位点均包含半胱氨酸（Cysteine） 残基，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽 键，故称天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解 酶（Cysteine aspartic acic specific protease），
即 Caspase。
的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，
便于细胞吞噬；导致膜脂重排（如：磷酯酰
丝氨酸由脂双层内页→外页），便于吞噬细
胞识别并吞噬。
路外 源 性 死 亡 受 体 通
凋亡诱导因素 死亡受体（Fas) 配体（FasL)的表 达、结合
FADD FADD
接头蛋白
Caspase-8活化
Caspase-3活化 apoptosis
一、细胞凋亡 一）细胞凋亡的概念及特征
1、细胞凋亡的概念：

一种有序的或程序性的细胞死亡方式，使细胞接受 某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应。

该过程具有典型的形态学和生化特征，凋亡细胞最
后以凋亡小体的形式被吞噬消化。 细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命 的过程，也常被称为细胞程序性死亡（即 PCD， programmed cell death)。
Caspase 的酶原活化
4） Caspase 的作用底物
目前已知的 Caspase 作用底物约 280 种
Caspase 的作用底物举例
① 凋亡蛋白酶激活的 DNA 酶抑制物（ICAD）
CAD DNA
Caspase
降解
ICAD
CAD: Caspase Activated DNase 由 Caspase 激活的核酸酶（具内切酶活性）
二）细胞凋亡的生理意义
1、凋亡的生理学意义：
1）生长发育：

组织与器官的塑造（趾的分化）；动物变态等 淋巴细胞的克隆选择 清除衰老细胞、DNA 损伤的细胞以及被病原体 感染的细胞。
2）免疫细胞分化：

3）防御作用：

1）蝌蚪尾巴的消失
蝌蚪在变态过程中，尾部细胞发生凋亡
2）脊椎动物的神经系统的发育
3）细胞凋亡过度
神经退行性疾病（AD，帕金森症）、心肌梗塞、
再生障碍性贫血、骨组织坏死等。
三）细胞凋亡的检测
◆ 形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察 ◆ DNA 电泳：DNA 片段呈现出梯状条带 ◆ TUNEL 测定法（DNA 断裂的原位末端标记法） ◆ 彗星电泳法（comet assay）
Caspase 的分类及功能（共 15 种）
炎症
Executioner or effector 执行者
Autocatalytic initiator 起始者 / 引发者
3）Caspase 的分类： A、起始者： 对执行者前体进行切割、激活 包括：Caspase-2，8，9，10，11 B、执行者： 切割胞质及核内的结构和调节蛋白，产生效应 包括：Caspase-3，6，7 4）Caspase 的激活阶段： C、激活期： 前期细胞应答死亡信号，起始 Caspase 活化 D、执行期： 后期执行 Caspase 活化，执行细胞死亡

Bcl-2（B-cell lymphoma gene 2）是一种原癌基
因，是线虫抗凋亡蛋白 Ced9 在哺乳类中的同源物，
与线粒体相结合，能改变线粒体外膜通透性（释
放凋亡因子 CytC），抑制或促进细胞凋亡。

Bcl-2 家族成员的基因根据功能不同可分为两组： A、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w 等抑制凋亡； B、Bax、Bak、Bad、Noxa 等促进凋亡。

Caspase 自身以非活化的酶原 Procaspase 存在， 其激活依赖于其他的 Caspase 在它的天冬氨酸 位点裂解活化或自身活化。
2）caspase 超家族成员及功能（15 种）
白介素前体的活化，不直 接参与凋亡信号的传递
执行者负责切割胞质及核内的 结构和调节蛋白，产生凋亡
对执行者前体进行切割，激活执行者