腺病毒
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退行性疾病、肿瘤和心血管疾病均获得较好的实验效果
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HDAd在疫苗中的应用
FGAd 因能够诱导抗腺病毒的免疫而导致应用受限。Harui用 HDAd 免疫 C57BL/6 小 鼠获得了比等量的 FGAd更好的转基因特异性 CTL 和抗体反应 ,并认为转基因的高效 表达引起机体产生了针对转基因的增强的免疫应答。
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HDAd展望
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HD-Ad的优点：
转基因表达时间长：有效地减少了机体的免疫反应，使外源
基因的表达持续时间明显延长；
转基因容量大：缺失病毒编码序列，大大提高了载体的包装能
力，可达到36kb；
安全性好，副作用小；
3个限制因素：
难于大规模生产病毒载体； 存在少量辅助病毒的污染；
HDAd的构建及制备
HDAd与免疫反应
HDAd的应用 HDAd展望
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HDAd的构建及制备
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HDAd
Helper virus
包装细胞株
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HDAd
缺失腺病毒基因组的所有编码基因 ,仅含有腺病毒基因组末端的非 编码基因倒置重复序列（ITR）及包装信号
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感染过程
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腺病毒载体介绍
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腺病毒载体的分类
第一代腺病毒载体：去除E1、E3区，插入外源基因的长度可达8kb； 第二代腺病毒载体：在去除E1、E3的基础上又将E2A突变或E4区
存在载体诱导的针对载体自身的免疫反应；
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产量
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辅助病毒
辅助病毒可反式提供腺病毒载体包装和复制所必需的结构和 功能蛋白 ,常是通过在第一代腺病毒载体包装信号两侧插入 一种重组酶的酶切位点构建而成
根据包装细胞株中不同的重组酶类型 ,插入辅助病毒包装信 号两侧的酶切位点也不同 , 例如: Cre-loxP、FLP-FRT 和 φC31-attB/attP 重组系统
缺失，允许插入最大约 14kb的外源序列；
第三代腺病毒载体：即辅助病毒依赖型腺病毒载体（Helper
dependentadenovirus, HD-Ad），缺乏所有编码序列，只含有约500bp 的顺式作用元件，用于DNA复制和包装；插入外源基因的序列可达 36kb;
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为保证载体的正常包装 ,缺失的基因组由“stuffer DNA”进行填充 , 同时克隆有相关的转基因
目前有数个 HDAd 的制备系统 ,原理和成分基本相同。在这些系统
中比较成功的是由加拿大麦克马斯特大学 Graham 教授设计的 HDAd 系统 ,该系统成功降低了辅助病毒污染 ,并大大提高了载体
腺病毒
——辅助病毒依赖型腺病毒载体的研究进展
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病毒载体
• 疱疹病毒载体
• 逆转录病毒载体
• 牛乳头瘤病毒载体 • 痘苗病毒载体
• 腺病毒载体：Ad2和Ad5
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腺病毒载体的优点
• 腺病毒粒子相对稳定，病毒基因组重排率低 • 安全性较好，未发现与人类肿瘤的发生有直接关 系 • 腺病毒基因组较大（36kb），插入大片段外源性
基因的潜力大
• 宿主细胞较广泛
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ห้องสมุดไป่ตู้
腺病毒的结构特征与感染过程
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结构特征
70-90nm
无包膜病毒，核衣壳呈20面体立体对称，直径70-90nm 双链DNA：被包于蛋白质外壳内 六邻体：每面12个，构成20面体的面及棱的大部分
五邻体：12个，位于20面体的12个顶点上，由基底和一根纤维突起组成（基底 对细胞有毒性，有组抗原特异性；纤维突起具有吸附蛋白，介导病毒吸附至易 感细胞表面）
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包装细胞株
通过在细胞染色体上整合位置特异的重组酶( site-specific
recombinase) 基因序列构建而成 ,这些重组酶基因序列包 括:Cre 序列、FRT序列等。
常见 的 包 装 细 胞 株 包 括 PERC62Cre 、116 、
293Cre4 、293Cre415 、293FRT、293CreFRT、CreE、 C72cre 、2932FLPe6 等
包装细胞株的研究主要集中在两个方向 ,一是设法获得可高
效表达重组酶或能同时表达两种重组酶的细胞株 ，二是设 法提高单个细胞 HDAd 的产量
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HDAd与免疫反应
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HDAd的应用
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HDAd在基因治疗中的应用
腺病毒对肝脏具有天然亲嗜性 , HDAd被广泛用于肝脏疾病 的基因治疗 ,并获得较好的实验效果
HDAd 因具有感染非分裂细胞、转染多种组织的能力 ,以及
安全等优点已被广泛用于神经系统疾病的基因治疗
HDAd 还被用于其他多种遗传性疾病的治疗 ,如:肥胖症、囊
性纤维病 、糖尿病 和血友病等疾病的治疗。另外 , 在神经
目前以 HDAd 作为疫苗载体的文献并不多见 ,其在疫苗中的价值还需要进一步探索。
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HDAd 在 RNA 干扰的应用
为确定用 HDAd 在肝脏表达 shRNA的可行性 ,Witting设计 了鼠fabp5 的 shRNA 结构，静脉注射后导致 75 %的 fabp5 不表达(沉默) 。
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HDAd在疫苗中的应用
FGAd 因能够诱导抗腺病毒的免疫而导致应用受限。Harui用 HDAd 免疫 C57BL/6 小 鼠获得了比等量的 FGAd更好的转基因特异性 CTL 和抗体反应 ,并认为转基因的高效 表达引起机体产生了针对转基因的增强的免疫应答。
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HD-Ad的优点：
转基因表达时间长：有效地减少了机体的免疫反应，使外源
基因的表达持续时间明显延长；
转基因容量大：缺失病毒编码序列，大大提高了载体的包装能
力，可达到36kb；
安全性好，副作用小；
3个限制因素：
难于大规模生产病毒载体； 存在少量辅助病毒的污染；
HDAd的构建及制备
HDAd与免疫反应
HDAd的应用 HDAd展望
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缺失腺病毒基因组的所有编码基因 ,仅含有腺病毒基因组末端的非 编码基因倒置重复序列（ITR）及包装信号
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腺病毒载体的分类
第一代腺病毒载体：去除E1、E3区，插入外源基因的长度可达8kb； 第二代腺病毒载体：在去除E1、E3的基础上又将E2A突变或E4区
存在载体诱导的针对载体自身的免疫反应；
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产量
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辅助病毒
辅助病毒可反式提供腺病毒载体包装和复制所必需的结构和 功能蛋白 ,常是通过在第一代腺病毒载体包装信号两侧插入 一种重组酶的酶切位点构建而成
根据包装细胞株中不同的重组酶类型 ,插入辅助病毒包装信 号两侧的酶切位点也不同 , 例如: Cre-loxP、FLP-FRT 和 φC31-attB/attP 重组系统
缺失，允许插入最大约 14kb的外源序列；
第三代腺病毒载体：即辅助病毒依赖型腺病毒载体（Helper
dependentadenovirus, HD-Ad），缺乏所有编码序列，只含有约500bp 的顺式作用元件，用于DNA复制和包装；插入外源基因的序列可达 36kb;
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为保证载体的正常包装 ,缺失的基因组由“stuffer DNA”进行填充 , 同时克隆有相关的转基因
目前有数个 HDAd 的制备系统 ,原理和成分基本相同。在这些系统
中比较成功的是由加拿大麦克马斯特大学 Graham 教授设计的 HDAd 系统 ,该系统成功降低了辅助病毒污染 ,并大大提高了载体
腺病毒
——辅助病毒依赖型腺病毒载体的研究进展
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• 疱疹病毒载体
• 逆转录病毒载体
• 牛乳头瘤病毒载体 • 痘苗病毒载体
• 腺病毒载体：Ad2和Ad5
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腺病毒载体的优点
• 腺病毒粒子相对稳定，病毒基因组重排率低 • 安全性较好，未发现与人类肿瘤的发生有直接关 系 • 腺病毒基因组较大（36kb），插入大片段外源性
基因的潜力大
• 宿主细胞较广泛
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腺病毒的结构特征与感染过程
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结构特征
70-90nm
无包膜病毒，核衣壳呈20面体立体对称，直径70-90nm 双链DNA：被包于蛋白质外壳内 六邻体：每面12个，构成20面体的面及棱的大部分
五邻体：12个，位于20面体的12个顶点上，由基底和一根纤维突起组成（基底 对细胞有毒性，有组抗原特异性；纤维突起具有吸附蛋白，介导病毒吸附至易 感细胞表面）
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包装细胞株
通过在细胞染色体上整合位置特异的重组酶( site-specific
recombinase) 基因序列构建而成 ,这些重组酶基因序列包 括:Cre 序列、FRT序列等。
常见 的 包 装 细 胞 株 包 括 PERC62Cre 、116 、
293Cre4 、293Cre415 、293FRT、293CreFRT、CreE、 C72cre 、2932FLPe6 等
包装细胞株的研究主要集中在两个方向 ,一是设法获得可高
效表达重组酶或能同时表达两种重组酶的细胞株 ，二是设 法提高单个细胞 HDAd 的产量
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HDAd在基因治疗中的应用
腺病毒对肝脏具有天然亲嗜性 , HDAd被广泛用于肝脏疾病 的基因治疗 ,并获得较好的实验效果
HDAd 因具有感染非分裂细胞、转染多种组织的能力 ,以及
安全等优点已被广泛用于神经系统疾病的基因治疗
HDAd 还被用于其他多种遗传性疾病的治疗 ,如:肥胖症、囊
性纤维病 、糖尿病 和血友病等疾病的治疗。另外 , 在神经
目前以 HDAd 作为疫苗载体的文献并不多见 ,其在疫苗中的价值还需要进一步探索。
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HDAd 在 RNA 干扰的应用
为确定用 HDAd 在肝脏表达 shRNA的可行性 ,Witting设计 了鼠fabp5 的 shRNA 结构，静脉注射后导致 75 %的 fabp5 不表达(沉默) 。