生物技术药物质量控制研究
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纯度：≧95%或98%
三、蛋白质含量测定
样品：原液、成品 方法： *Folin-酚试剂法（Lowry法）：
简便、灵敏、优先采用，灵敏度：5-100ug/ml *染色法（Bradford法）：
考马斯亮蓝G-250，简便灵敏， 25-200ug/ml
用于原液比活性计算和成品规格控制
四、蛋白质药物理化性质鉴定
第四章生物技术药物质控研究
生物技术药物的质控体系 蛋白质类生物技术药物的质量标准 其它类型生物技术药物的质量标准 制造与检定规程、标准复核与注册检定 生物技术药物标准品研究 生物技术药物稳定性研究
第一节 生物技术药物的质控体系 —研究与制定依据
《中国药典》，2005版三部（生物制品） 各类指导原则，SFDA、ICH
（二）相对分子量测定
1、样品：原液 2、方法：还原型SDS-PAGE、质谱法 3、标准：
1）理论值±10%范围 2）批与批间一致
（三）等电点（IE）测定
1、样品：原液 2、方法：
IEF：常规等电聚胶电泳 CE：毛细管电泳 3、标准： 1）有明显主带 2）理论值±0.5pH范围 3）批与批间一致
（四）紫外吸收光谱分析
2、细胞基础的活性测定 促细胞生长法：大多数细胞因子类 抑制细胞生长法：细胞毒素、血管抑制剂 间接保护细胞法：IFN保护WISH 3、酶学基础的活性测定：重组酶类 4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定：
抗原决定簇与活性中心常不一致
（三）生物学活性测定方法选择
1、细胞培养法＞离体器官法＞体内法 2、细胞染色标记方法：
测定方法
规定标准
动物基础的活性测定
70%-130%标示量
细胞基础的活性测定
80%-120%标示量
酶学基础的活性测定
85%-115%标示量
结合反应的活性测定
85%-115%标示量
（五）蛋白质药物的比活性
1、样品：原液 2、定义与计算：
比活性：单位重量蛋白的活性单位数 （IU/mg) 3、标准：不小于。。。IU/mg 4、意义： 1）真实反映有活性的蛋白质所占的比例
第二节 重组蛋白质药物质量标准研究
效价：生物学活性与比活性 蛋白质纯度 蛋白质含量 理化性质鉴定（部分非常规） 残余杂质 安全性及其它项目
一、生物学活性与比活性
生物学活性检测的意义 生物学活性测定方法分类 生物学活性测定方法的选择 生物学活性测定 蛋白质药物的比活性
（一）生物学活性检测的意义
个氨基酸顺序、肽图
成品质量标准
鉴别试验：免疫印迹法/斑点法，阳性 物理检查：外观、可见异物、装量 化学检定：水分、pH值 生物学活性：标示量的%范围 无菌检查：不得检出 内毒素检查： ≤10EU/剂量 异常毒性检查：符合规定
1、样品：原液、成品 2、方法：
DNA点印迹杂交法，地高辛标记 DNA标准品：厂家提供 3、标准： DNA含量≤10ng/剂量
细菌内毒素含量测定
1、样品：原液、成品 2、方法：
鲎试剂分析法 鲎试剂标准品：中检所提供 3、标准： 内毒素含量≤1０ＥＵ/剂量
六、安全性及其它检测项目
（一）无菌试验 平皿法，需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体
1、样品：原液 2、方法：紫外扫描 3、标准：
1）最大吸收波长与特征波长一致 2）批与批间一致
（五）肽图分析
1、样品：原液 2、方法：
溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/ SDS-PAGE/CE/质谱法
3、标准： 1）有特征性图谱 2）批与批间一致
（六）氨基酸组成分析
1、样品：原液 2、方法：
HCl/NaOH水解（仅用于Trp测定） +氨基酸自动分析仪 3、标准： 1）与理论值一致 2）批与批间一致
（七）氨基酸序列分析
1、样品：原液 2、方法：
N末端： 15个残基，
Edman化学降解法，蛋白质全自动测序仪
C末端： 1-3个残基
硫氰酸酯/羧肽酶降解法，RP-HPLC
3、标准： 1）与理论值一致 2）批与批间一致
五、残余杂质检测
（一）宿主相关杂质 1、宿主细胞蛋白含量 2、宿主细胞DNA含量 3、细菌内毒素含量
（二）热原试验 鲎试剂法或家兔法
（三）异常毒性试验 小鼠（1ml)或豚鼠（5ml），腹腔注射
（四）水分、装量、pH值
原液质量标准
生物学活性、比活性 蛋白质含量 纯度：≧95%，非还原SDS-PAGE法、HPLC法 分子量：还原型SDS-PAGE法、质谱法 外源性DNA残留量： ≤10ng/剂量 宿主蛋白残留量: ≦0.1%，0.05% 残余抗生素：不得检出 细菌内毒素：≤10EU/剂量 结构确证：等电点、紫外吸收、氨基酸组成、N末端15
染色方法与上样量
银染: 5ug（检测限为1-10ng） 考马斯亮蓝R-250：10ug（检测限为0.1ug）
定量方法：凝胶扫描 标准：无明显杂带，纯度≧95%或98%
HPLC法测纯度
分析柱：反相柱、离子柱、分子筛 应尽量采用反相柱或离子柱 应注明采用的分析柱性质
上样量：5ug 标准：出峰时间正确
《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》 《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则 》 《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》 《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》
国外药典：
《美国药典》、 《欧洲药典》 、《日本药局方》
制品的特点
第一节 生物技术药物的质控体系
—全过程质量控制
细胞库
菌种
细胞基质、目的基因、载体、 杂菌、病毒、致病因子等
发酵工艺
中间体
表达水平、总产量
分离纯化工艺
中间体
得率、产量、纯度、活性等
除菌过滤
原液
质量标准，全面检定
制剂工艺
（无菌操作）
成品
质量标准，全面检定
第一节 生物技术药物的质控体系 —质量标准研究内容
检定方法、质控标准 理化性质：外观（形状、颜色、气味）、pH 均一性：纯度、浓度 鉴别 结构确证 效价：生物学活性、免疫学活性 残余杂质：产品、工艺、环境相关的杂质 起草、制定《制造与检定规程》 研究建立国家标准品或参考品
（二）工艺相关杂质 如残余抗生素、IgG、蛋白A、小牛血清
（三）产品相关杂质 如多聚体、不同的PEG修饰产物
宿主细胞蛋白含量测定
1、样品：原液、成品 2、方法：
双抗体夹心ELISA：用HAS作保护 宿主蛋白标准品：中检所提供 3、标准： 1）大肠杆菌≤0.1% 2）CHO ≤0.05%
宿主细胞DNA含量测定
（一）特异性鉴别试验 （二）相对分子量测定 （三）等电点测定 （四）紫外吸收光谱分析 （五）肽图分析（非常规） （六）氨基酸组成分析（非常规） （七）氨基酸序列分析（非常规） （八）其它：二硫键、糖基化（非常规）
（一）特异性鉴别试验
1、样品：原液和成品 2、方法：免疫印迹法
Western Blot、 Dot Blot 3、标准：应该阳性
厂家间、表达系统间、批间比较 2）便于配制成品
二、蛋白质纯度检查
样品：原液 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ方法：必须采用二种方法测定
非还原SDS-PAGE法 HPLC法 标准：纯度均须达到95%或98%以上
非还原SDS-PAGE法测纯度
SDS-PAGE：据分子大小分离 样品处理：样品不加β-ME或DTT
二硫键未打开，反映单体、二聚体或多聚体情况
获取准确的效价信息、保证产品有效 效价：有效性指标，反映药品效力 生物学活性才能真实反映生物技术药效价
原因： 分子大、结构复杂、不稳定，使得重量与
效价不一致 化学药：～毫克 生物技术药：～单位（U、AU、IU）
（二）生物学活性测定方法分类
1、动物基础的活性测定 离体动物器官法：脑利钠肽的兔主动脉 体内测定法： EPO的小鼠网织红细胞
MTT ＞3H-Thymidine ＞流式细胞仪 （测细胞周期、凋亡） 3、定量法＞半定量法＞定性法 4、生物学活性不一定与临床药效类型一致 工艺稳定、测生物活性特别复杂时，可 替代。 如rh-GH用HPLC
（四）生物学活性测定
1、样品：原液、成品
2、方法：如上述
3、标准：
不同生物活性测定方法的规定标准
三、蛋白质含量测定
样品：原液、成品 方法： *Folin-酚试剂法（Lowry法）：
简便、灵敏、优先采用，灵敏度：5-100ug/ml *染色法（Bradford法）：
考马斯亮蓝G-250，简便灵敏， 25-200ug/ml
用于原液比活性计算和成品规格控制
四、蛋白质药物理化性质鉴定
第四章生物技术药物质控研究
生物技术药物的质控体系 蛋白质类生物技术药物的质量标准 其它类型生物技术药物的质量标准 制造与检定规程、标准复核与注册检定 生物技术药物标准品研究 生物技术药物稳定性研究
第一节 生物技术药物的质控体系 —研究与制定依据
《中国药典》，2005版三部（生物制品） 各类指导原则，SFDA、ICH
（二）相对分子量测定
1、样品：原液 2、方法：还原型SDS-PAGE、质谱法 3、标准：
1）理论值±10%范围 2）批与批间一致
（三）等电点（IE）测定
1、样品：原液 2、方法：
IEF：常规等电聚胶电泳 CE：毛细管电泳 3、标准： 1）有明显主带 2）理论值±0.5pH范围 3）批与批间一致
（四）紫外吸收光谱分析
2、细胞基础的活性测定 促细胞生长法：大多数细胞因子类 抑制细胞生长法：细胞毒素、血管抑制剂 间接保护细胞法：IFN保护WISH 3、酶学基础的活性测定：重组酶类 4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定：
抗原决定簇与活性中心常不一致
（三）生物学活性测定方法选择
1、细胞培养法＞离体器官法＞体内法 2、细胞染色标记方法：
测定方法
规定标准
动物基础的活性测定
70%-130%标示量
细胞基础的活性测定
80%-120%标示量
酶学基础的活性测定
85%-115%标示量
结合反应的活性测定
85%-115%标示量
（五）蛋白质药物的比活性
1、样品：原液 2、定义与计算：
比活性：单位重量蛋白的活性单位数 （IU/mg) 3、标准：不小于。。。IU/mg 4、意义： 1）真实反映有活性的蛋白质所占的比例
第二节 重组蛋白质药物质量标准研究
效价：生物学活性与比活性 蛋白质纯度 蛋白质含量 理化性质鉴定（部分非常规） 残余杂质 安全性及其它项目
一、生物学活性与比活性
生物学活性检测的意义 生物学活性测定方法分类 生物学活性测定方法的选择 生物学活性测定 蛋白质药物的比活性
（一）生物学活性检测的意义
个氨基酸顺序、肽图
成品质量标准
鉴别试验：免疫印迹法/斑点法，阳性 物理检查：外观、可见异物、装量 化学检定：水分、pH值 生物学活性：标示量的%范围 无菌检查：不得检出 内毒素检查： ≤10EU/剂量 异常毒性检查：符合规定
1、样品：原液、成品 2、方法：
DNA点印迹杂交法，地高辛标记 DNA标准品：厂家提供 3、标准： DNA含量≤10ng/剂量
细菌内毒素含量测定
1、样品：原液、成品 2、方法：
鲎试剂分析法 鲎试剂标准品：中检所提供 3、标准： 内毒素含量≤1０ＥＵ/剂量
六、安全性及其它检测项目
（一）无菌试验 平皿法，需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体
1、样品：原液 2、方法：紫外扫描 3、标准：
1）最大吸收波长与特征波长一致 2）批与批间一致
（五）肽图分析
1、样品：原液 2、方法：
溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/ SDS-PAGE/CE/质谱法
3、标准： 1）有特征性图谱 2）批与批间一致
（六）氨基酸组成分析
1、样品：原液 2、方法：
HCl/NaOH水解（仅用于Trp测定） +氨基酸自动分析仪 3、标准： 1）与理论值一致 2）批与批间一致
（七）氨基酸序列分析
1、样品：原液 2、方法：
N末端： 15个残基，
Edman化学降解法，蛋白质全自动测序仪
C末端： 1-3个残基
硫氰酸酯/羧肽酶降解法，RP-HPLC
3、标准： 1）与理论值一致 2）批与批间一致
五、残余杂质检测
（一）宿主相关杂质 1、宿主细胞蛋白含量 2、宿主细胞DNA含量 3、细菌内毒素含量
（二）热原试验 鲎试剂法或家兔法
（三）异常毒性试验 小鼠（1ml)或豚鼠（5ml），腹腔注射
（四）水分、装量、pH值
原液质量标准
生物学活性、比活性 蛋白质含量 纯度：≧95%，非还原SDS-PAGE法、HPLC法 分子量：还原型SDS-PAGE法、质谱法 外源性DNA残留量： ≤10ng/剂量 宿主蛋白残留量: ≦0.1%，0.05% 残余抗生素：不得检出 细菌内毒素：≤10EU/剂量 结构确证：等电点、紫外吸收、氨基酸组成、N末端15
染色方法与上样量
银染: 5ug（检测限为1-10ng） 考马斯亮蓝R-250：10ug（检测限为0.1ug）
定量方法：凝胶扫描 标准：无明显杂带，纯度≧95%或98%
HPLC法测纯度
分析柱：反相柱、离子柱、分子筛 应尽量采用反相柱或离子柱 应注明采用的分析柱性质
上样量：5ug 标准：出峰时间正确
《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》 《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则 》 《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》 《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》
国外药典：
《美国药典》、 《欧洲药典》 、《日本药局方》
制品的特点
第一节 生物技术药物的质控体系
—全过程质量控制
细胞库
菌种
细胞基质、目的基因、载体、 杂菌、病毒、致病因子等
发酵工艺
中间体
表达水平、总产量
分离纯化工艺
中间体
得率、产量、纯度、活性等
除菌过滤
原液
质量标准，全面检定
制剂工艺
（无菌操作）
成品
质量标准，全面检定
第一节 生物技术药物的质控体系 —质量标准研究内容
检定方法、质控标准 理化性质：外观（形状、颜色、气味）、pH 均一性：纯度、浓度 鉴别 结构确证 效价：生物学活性、免疫学活性 残余杂质：产品、工艺、环境相关的杂质 起草、制定《制造与检定规程》 研究建立国家标准品或参考品
（二）工艺相关杂质 如残余抗生素、IgG、蛋白A、小牛血清
（三）产品相关杂质 如多聚体、不同的PEG修饰产物
宿主细胞蛋白含量测定
1、样品：原液、成品 2、方法：
双抗体夹心ELISA：用HAS作保护 宿主蛋白标准品：中检所提供 3、标准： 1）大肠杆菌≤0.1% 2）CHO ≤0.05%
宿主细胞DNA含量测定
（一）特异性鉴别试验 （二）相对分子量测定 （三）等电点测定 （四）紫外吸收光谱分析 （五）肽图分析（非常规） （六）氨基酸组成分析（非常规） （七）氨基酸序列分析（非常规） （八）其它：二硫键、糖基化（非常规）
（一）特异性鉴别试验
1、样品：原液和成品 2、方法：免疫印迹法
Western Blot、 Dot Blot 3、标准：应该阳性
厂家间、表达系统间、批间比较 2）便于配制成品
二、蛋白质纯度检查
样品：原液 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ方法：必须采用二种方法测定
非还原SDS-PAGE法 HPLC法 标准：纯度均须达到95%或98%以上
非还原SDS-PAGE法测纯度
SDS-PAGE：据分子大小分离 样品处理：样品不加β-ME或DTT
二硫键未打开，反映单体、二聚体或多聚体情况
获取准确的效价信息、保证产品有效 效价：有效性指标，反映药品效力 生物学活性才能真实反映生物技术药效价
原因： 分子大、结构复杂、不稳定，使得重量与
效价不一致 化学药：～毫克 生物技术药：～单位（U、AU、IU）
（二）生物学活性测定方法分类
1、动物基础的活性测定 离体动物器官法：脑利钠肽的兔主动脉 体内测定法： EPO的小鼠网织红细胞
MTT ＞3H-Thymidine ＞流式细胞仪 （测细胞周期、凋亡） 3、定量法＞半定量法＞定性法 4、生物学活性不一定与临床药效类型一致 工艺稳定、测生物活性特别复杂时，可 替代。 如rh-GH用HPLC
（四）生物学活性测定
1、样品：原液、成品
2、方法：如上述
3、标准：
不同生物活性测定方法的规定标准