血管平滑肌细胞原代培养经验

兔血管平滑肌细胞原代培养
我是某医学院的硕士研究生，课题涉及到兔血管平滑肌细胞的原代培养，实验开始非常不顺利，进行了几次实验均一无所获。

后来我在丁香园上发帖提问
（/bbs/topic/16215850?tpg=1&ppg=1&age=0#0），得到了丁香园网友的热情帮助，在网友的帮助下，经过不断尝试改进，最后我终于得到了想要的血管平滑肌细胞，完成了实验并顺利毕业。

鉴于网上还有很多网友在提有关血管平滑肌细胞原代培养的问题，我现在将自己的毕业论文中细胞培养的部分共享，由于论文还没发表，部分图片不能公开，请见谅！欢迎转载。

①DMEM培养基的配制：
在新购进的500ml DMEM/F12培养基内加入5ml双抗及适当比例的FBS(原代20%，3代后5%)，配制成完全培养基，4℃保存备用。

②兔SVMCs的原代培养：
体重2kg～3kg的雄性日本大耳白兔，耳缘静脉注射空气栓塞处死后，置于操作台。

从腹部切开，分离腹部血管，暴露腹主动脉，无菌条件下切下约5cm长的动脉，装入含双抗的PBS中备用。

在超净台内将取材的血管在DMEM中漂洗数次，小心将外膜剥去，用双抗浸泡数分钟后，直接加入胰酶，在胰酶双抗混合液中用眼科剪将组织块剪碎，将双抗和胰酶混合后用1ml移液枪吸去，加入3ml培养基,用吸管吹打后将组织块和培养液吸入25cm2细胞培养瓶中，直接用移液器将液体大部分吸出，盖紧瓶口后瓶口向上竖立放入培养箱，约1.5h后加入DMEM/F12培养基(含20%FBS, 1%双抗)，每个培养瓶约2.0ml，缓慢将瓶身翻转，使培养基覆盖组织块，将瓶口拧松，放入CO2养箱，静置3d～4d观察。

这是手术中的图片，上面灰白的那根是腹主动脉。

这是超净台里剥开了一半的血管，要的是上面这部分，下面的是血管外膜及筋膜等，丢弃
这是剪碎了的组织块，泡胰酶和泡双抗都是这么泡，后期我做的时侯比这个剪得还要碎:
这是剪好后放到培养箱里的图片，瓶口向上立着的两瓶是我的。

③细胞分散(这步也比较重要，一瓶里面几十个组织块，只有几个甚至一个组织块有细胞游出，不分散的话，传代细胞很少，养不活，不传代的话细胞老在一个地方长，挤得要命，也难养活的）：
原代组织块一般5d～7d有细胞游出，当游出的细胞在部分组织块周围密集成层后即可
进行细胞分散。

弃原培养基，0.25%胰酶-EDTA 1ml消化细胞，40s后弃大部份胰酶，继续
在显微镜下观察消化情况并拍打培养瓶，当有细胞浮起游动时，加入6mlDMEM/F12培养基，终止消化。

继续晃动培养瓶，观察到细胞大部份浮起，放入培养箱中。

3d换液一次，待细
胞长满后按1:3比例传代或者冻存。

(以下几步恕无法提供图片）
④HE染色观察兔VSMCs:
将生长良好的第3代细胞消化后接种于放有载玻片并经高压消毒的玻璃平皿中，待4h
细胞贴壁后，向玻璃平皿中补足培养液，继续培养。

细胞爬满后，取出爬片，用PBS冲洗，乙醚酒精固定，用电吹风吹干。

进行HE染色，步骤如下：蒸馏水洗2mins->苏木精染色
10mins->自来水洗1min->1%盐酸酒精分化20s->自来水洗1min->稀氨水蓝化1min->70%酒精
2mins->伊红染色1min->80%酒精脱水30s->95%酒精30s->无水酒精I2mins->无水酒精
II2mins->无水酒精III2mins->二甲苯I5mins->二甲苯II5mins。

中性树胶封片，显微镜下观察，拍照。

⑤兔VSMCs的免疫组化鉴定：
将生长良好的第3代细胞消化后接种于放有载玻片并高压消毒的玻璃平皿中，待4h细
胞贴壁后，向玻璃平皿中补足培养液，继续培养。

细胞爬满后，取出爬片，用PBS冲洗2次，甩干后加入乙醚酒精，数秒后用吹风机吹干。

用PBS冲洗3次，每次冲洗后等待3min，再
冲洗下一次。

加入曲拉通X-100，等待10min，再用PBS冲洗3次。

加入双氧水，
10min，PBS冲洗3次后加入一抗。

4℃下过夜。

次日早晨取出载玻片，PBS冲洗3次，加入二抗，室温下15min，PBS冲洗3次。

加入新配的DAB显色剂（0.85ml蒸馏水，再加DAB
缓冲液，DAB底物，DAB染色液各一滴，混匀），7min后，用自来水冲洗，复染苏木素（过程：DAB染色后蒸馏水泡2min->苏木素复染1.5min->自来水洗30s->盐酸酒精分化20s->温水返蓝1min->80%酒精2min->95%酒精2min->无水酒精I2min->无水酒精II2min->二甲苯I5min->二甲苯II5min)。

然后滴加中性树胶，放上盖玻片，显微镜下观察，拍照。

⑥兔VSMCs的透射电镜观察：
取出两瓶生长良好的细胞，PBS冲洗两次后加入胰酶，消化约30s后待细胞变圆时弃胰酶，加入5ml培养基，吹打后将两瓶细胞悬液合并后放入15ml离心管，1000rpm离心5ml
后小心弃上清，用移液器缓缓加入固定液约1ml，送电镜室进行透射电镜观察。

相关讨论
本实验主要采用组织贴块法，进行了以下改进：1.在将血管中膜组织块剪碎至1mm3大
小后，移入培养瓶前，用0.25%胰酶消化组织块1min，然后用含FBS的DMEM培养基终止
消化，再将组织块移入培养瓶中。

可以使细胞基质的主要物质胶原纤维得以减少，组织块变得疏松，有利于VSMCs从组织块中游离出，加快了细胞的生长速度，缩短了细胞融合时间。

2.组织块移入培养瓶后，文献报道多为将培养瓶翻转，有组织块的培养瓶底面朝上放置3h～4h后再小心翻转培养瓶，使组织块与培养基接触。

在实验中我们发现这样3h～4h后组织块周围仍很潮湿，使其不能很好贴于瓶底，翻瓶后仍有很多组织块漂起。

我们在实验中将翻瓶改进为将培养瓶口朝上竖立放入培养箱，利用液体的重力作用使瓶底（尤其是组织块周围）的液体流至瓶底部，这样减少了翻瓶的等待时间，2h后翻瓶，飘起的组织块很少。

这样使组织块能够尽早接触培养液，有利于细胞更早游出。

3.采用含20%FBS的DMEM培养基比含10%FBS的培养基实验更有利于细胞游出。

4.当游出的细胞在少数组织块周围爬出较多并已生长分层后，应当及时进行细胞分散，即用胰酶消化至细胞变圆后加入含血清培养基终止消化，使细胞漂浮至培养瓶各处，在培养瓶中均匀分布，减少细胞长满的时间。

尽管进行了上述改进，实验结果显示组织贴块法原代培养VSMCs的成功率仍很低。

本实验一共进行了22次原代取材，最后统计结果有细胞游出的共有6次，成功率约27%。

其余未见细胞游出的情况中，组织块污染的有8次，占36%，还有8次是长时间（1个月）无细胞游出,占36%。

因此污染和无细胞游出是组织贴块法原代培养VSMCs失败的主要原因。

在有细胞游出的6次中，游出最早的为取材后第6d，最迟的为取材后20d，平均细胞游出时间为11.3d。