分子生物学操作基本技术解析

微生物质粒DNA与染色体DNA差别在于：
（1）宿主细胞染色体DNA分子量明显大于细胞所含质粒
DNA分子量，如大肠杆菌（Escherichia coli）染色体
的DNA分子为4.6×103kb左右，而通常用于基因工程 中的载体一般均小于10kb，1~100×106Da。
（2）质粒所携带的遗传信息量较少。携带的遗传信息所一般 只与宿主细胞的某些次要特性有关，而并不关系到细胞 的生死存亡。
溶液I中的葡萄糖的作用是增大粘度，减少提取过程中的机械剪切力， 防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与二价离子（Ca2＋）结合， 降低DNase对DNA的降解。
4 加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管,以混匀内容 物,冰上放置3－5min; 溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变性 并形成交联的网状结构
溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L
KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，
反向筛选标记
Nucleic Acid Research ,2006 , IF :7.552
二、针对质粒和总DNA的操作
质粒的提取 总DNA的提取 质粒或DNA片段的酶切 酶连 电泳 酶切产物的回收
1. 质粒的提取
溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)；
讲课内容：
质粒操作（提取、酶切、电泳） 细菌DNA提取 细菌间基因重组
一、细菌核酸的基本知识
1、染色体
主要遗传成分，携带基本代谢的全部基因，呈共价闭合环状 (Covalently Closed Circle，简称CCC) ，一般只有一条，在细 胞中以紧密缠绕成的较致密的拟核(nucliod)，其上结合有类 组蛋白蛋白质和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚 架形的致密结构。
染色体上编码各种功能的基因比例,%
编码的功能)
代谢 结构 运输 调节 翻译 转录 复制 已知的其他 未知
大Fra Baidu bibliotek杆菌
(Escherichia coli)
21.0 5.5 10.0 8.5 4.5
1.3 2.7 8.5 38.1
流感嗜血菌
生殖道枝原体
(Haemophilus （ Mycoplasma
influenzae) genitalium）
（可以在许多种细菌中复制）
质粒的相容性：不同质粒在同一宿主细胞内的共存性。
基因工程质粒载体的特点
有一个复制起始点，能自主复制； 具有明显的筛选标记，如：
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍 生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。
19.0 4.7 7.0 6.6 8.0
14.6 3.6 7.3 6.0 21.6
1.5 4.9 5.2 43.0
2.6 6.8 5.8 32.0
2、质粒
一种独立于染色体外， 能进行自主复制的细胞 质遗传因子。
通常以共价闭合环状的超螺 旋双链DNA分子存在于细 胞中；
质粒分子的大小范围从1kb 左右到1000kb；（细菌质粒 多在10kb以内）
pH8.0。
1 挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37℃ 震荡培养12～16小时；
2 将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000 g离心30 Sec，弃上清液，在吸 水纸上扣干；
离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮
3 加入100L预冷的溶液I ，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量 使细胞分散；
———————松弛型质粒(relaxed plasmid)
低拷贝数(low copy number)质粒 （每个宿主细胞中有1-4个拷贝）
———————严谨型质粒(stringent plasmid)
窄宿主质粒(narrow host range plasmid)
（只能在一种特定的宿主细胞中复制）
广宿主质粒(broad host range plasmid)
生物 分子量（Da） 碱基对约数 长度（mm）
蛙 人 果蝇 脉孢菌 大肠杆菌 噬菌体T2 λ噬菌体
— — — 2.8×1010 2.5×109 1.3×108 3.2×107
多瘤病毒 3×106
2.3×1010 3×109 8×107 4.5×107 4.6×106 3×105 5×104
—
6700 870 24 — 1.5 0.056 0.016 —
质粒具有下列特性：
① 可转移性。即某些质粒可以细胞间的接合作 用或其它途径从供体细胞向受体细胞转移。
② 可整合性。在某种特定条件下，质粒DNA可以可逆 性地整合到宿主细胞染色体上，并可以重新脱离。
③可消除性。经某些理化因素处理如加热、或加入丫 啶橙或丝裂霉素C、溴化乙锭等，质粒可以被消除。
高拷贝数(high copy number)质粒 （每个宿主细胞中有10-100个拷贝）
纯化标签His-tag和Stag
凝血酶切点 蓝白斑筛选需要诱导
广宿主载体pBBRMCS系列
复制起始位点通用 Mob负责接合转移 蓝白斑无须诱导
自杀性载体pSC123
复制起始位点需要 特殊蛋白结合
TraJ负责接合转移 Mariner负责跳跃
pBK-CMV：原核、真核双元表达载体
有克隆位点（MCS 外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位 点，称为多克隆位点；
分子量尽量小，以容纳较大的外源DNA。
本来不能在含青霉素的平板上生长的受体菌在转化子（含有 Ampr质粒）周围形成卫星菌落（b-内酰胺酶分泌到胞外所致）
克隆载体：pUC18/19
注意： 蓝白斑需要诱导
启动子－核糖体结合 位点－克隆位点－转 录终止信号。