分子生物学导论-分子生物学研究方法

分子生物学导论-分子生物学研究
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方法
结果
四、影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素 1. DNA的分子大小 5. 电场方向
2. 琼脂糖浓度
6. 碱基组成与温度
3. DNA的构象
7. 嵌入染料的存在
4. 所加电压
8. 电泳缓冲液的组成
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1. DNA分子大小: 线性双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的
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一、基本原理
一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移 向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移 速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身 所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳 分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快，反之 则较慢。由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持 介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，故电泳的迁移 率与分子的摩擦系数成反比。
是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为
多聚阴离子（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，
它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的
重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因
此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。
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分离DNA片段的大小范围（bp） 50 000~1 000 20 000~1 000 6 000~300 1 000~100 500~25 50~1
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三、基本步骤（琼脂糖凝胶为例）
称样
溶解
加热
制板
倒胶
取样 电泳
点样 检测
◆ 溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子 可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色 荧光。即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA，也可以 被清晰地检测出来。
移率降低15%。
6. 离子强度影响: 在没有离子存在时，电导率最小，DNA几乎不
移动。在高离子强度的缓冲液中，电导很高并明显产热，严
重时会引起凝胶熔化分子或生物D学N导A论变-分性子生。物学研究
已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数，
因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带
的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混
合物中的各种成分彼此分离开来。
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阴极
DNA加样孔
阳极
源自文库大分子量的DNA 移动的慢
小分子量的DNA
移动的快
电泳缓冲液
在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，
方法
二、类型
1. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间
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2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基 对之间
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方法
（1）变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离与纯化。变性的
第九章
分子生物学研究方法（1）
学习目的和要求: 了解并掌握分子生物学常用的研
究方法原理和技术。
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第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节 第十节 第十一节
凝胶电泳技术 核酸的分离技术 基因扩增与定点突变技术 DNA重组技术 基因分离技术 分子杂交技术 核酸序列分析技术 转基因技术 RNAi技术 基因敲除技术 (gene knock-out) 蛋白组学及其研究技术
第一节 凝胶电泳技术
一、基本原理 二、类型(琼脂糖凝胶电泳；PAGE) 三、基本步骤 四、影响因素
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第一节 凝胶电泳技术
(教材p.161-162)
自从琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺 (polyacrylamide) 凝胶被引入核酸研究以来，按分子 量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一 种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用 的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学 研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、 限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术 基础，受到科学界的高度重视。
◆ 银染色: 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合
物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电
泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用
于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，
DNA不宜回收。
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溴化乙锭（EB） ➢ 结合的EB的荧光产率远大于游离EB的荧光产率。 ➢ EB结合量的多少与DNA的大小和构型有关，而荧光强度 正比于嵌入溴化乙锭的量。 ➢ 对于单一构型的同种DNA样品来说，溴化乙锭的嵌入量与 样品溶液的DNA含量成正比。 ➢ EB具有中度毒性、强致癌性，操作时切记戴手套，切勿 沾染到衣物、皮肤、眼晴、口鼻等。沾有EB的用具使用完毕 统一集中于回收容器中，经净化处理后方可弃。
迁移速率与DNA分子量对数成反比。
2. 琼脂糖浓度。
3. DNA分子构象: 相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA。
超螺旋>开环>线状。
4. 电源电压: 电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要
使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超
过5v/cm。
5. 嵌入染料的存在: 染料嵌入堆积的碱基对之间，使线状DNA迁
方法
凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高 低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能 力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随 之减弱。
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
DNA在凝胶中的迁移率几乎与碱基组成及序列完全 无关。
主要用途包括放射性DNA探针的分离、S1核酸 酶消化产物的分析和DNA测序反应产物的分析。
（2）非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 主要用途为制备高纯度的DNA片段和检测蛋白
质-DNA复合物。
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