第七章 常见的色谱分离技术

注意：进胶过程宜连续、均匀、不中断， 并不断搅拌。
4、平衡
色谱柱填装好后，必须用3-5个柱床体积的起 始缓冲液（0.6%NaCI）平衡到与之pH和离子 强度相同时才可使用。 装好的柱子要求均匀，无纹路，无气泡，柱 顶部平整。 用蓝色葡聚糖-2000在恒压下走柱，若色带均 匀下降，则柱填装均匀。
5、加样
Ve：洗脱体积； Vo：外水体积；
Vi：内水体积
1、大分子：完全排阻于凝胶颗粒之外 Ve = Vo
Ve = Vo + Vi
Kd = 0
Kd = 1
2、小分子：完全进入凝胶颗粒之外
3、介于大小分子之间：
Ve = Vo + Kd· Vi
0 < Kd < 1
对特定分子，Kd（在内水/外水中的分配系数）是常数
层析介质 葡聚糖凝胶G10 葡聚糖凝胶G15 葡聚糖凝胶G25
分离范围 （球蛋白）
<700Da <1500Da 1000-5000Da
相应产品 SephadexG10 SephadexG15 SephadexG25
葡聚糖凝胶G50 葡聚糖凝胶G75
1.5-30kDa 3-80kDa
SephadexG50 SephadexG75
注意：葡聚糖凝胶在水、盐溶 液、弱酸及弱碱溶液中稳定性 较好，但长期于强酸及强氧化 剂接触会破坏胶粒。微生物可 使其降解，要注意防止发霉。
③ 、Sephadex G-50 G表示不同规格型号的葡聚糖； 数字50：代表交联度，数字越小，交联度越 大； 数字50：还表示凝胶得水值的10倍，即每克 凝胶膨胀时吸水5克。
根据待分离物质的分子量大小 不同、在凝胶内流过的速度存 在差异而进行分离。
1、分子量大的溶质组分完全不能进入凝胶颗粒内的 孔隙中，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙随溶剂移动。 当流完自由空间后就从柱的下端流出。 2、分子量小的组分，可渗入凝胶颗粒内的孔隙中。 因此在流完自由空间和全部凝胶颗粒的内空隙之后， 才从柱的下端流出。 3、介于大小分子之间的组分，只能进入一部分颗粒 内较大的孔隙，淋洗时此组分是流过全部自由空间 加上它能进入的颗粒内孔隙，才从柱的下端流出。 在这一色谱柱的淋洗过程中，大分子的流程短， 移动速度快，先流出色谱柱；小分子的流程长，移 动速度慢，后流出色柱；而中等分子居两者之间。
Sephadex G-10、G-15、G-25常用于样品脱盐
牛血清白蛋白：分子量为66kDa
溶菌酶：分子量为14kDa 层析介质 葡聚糖凝胶G10 分离范围 （球蛋白） <700Da 相应产品 SephadexG10
葡聚糖凝胶G15
葡聚糖凝胶G25 葡聚糖凝胶G50 葡聚糖凝胶G75
<1500Da

（五）、凝胶层析的应用 1、脱盐：Sephadex G-10、G-15、G-25 2、分离提纯 3、测定大分子物质的分子量
洗 脱 体 积
标准曲线
分子量的对数
4、高分子溶液的浓缩 原理：干胶的吸水性、吸收小分子物质
SephadexG-25或50 + 高分子溶液
离心或过滤
浓缩的高分子溶液
另一种操作模式：将浓缩液装入透析袋，平放于 培养皿，袋外撒上吸水凝胶，放置30min
溶菌酶活力测定：以黄色小球菌 为底物，测定其在 450nm 的光吸 收，根据光吸收值是否下降判断 是否含有溶菌酶。
8、脱盐和浓缩 脱盐：透析法 浓缩：聚乙二醇
9、凝胶的保存
凝胶柱用过后，反复用蒸馏水洗柱；如果凝胶有颜 色或比较脏，需用 0.5mol/L 的氯化钠溶液洗柱，再 用蒸馏水洗柱。 一次装柱后可以反复使用 ①干燥保存（较长时间不用）： 水→70％乙醇→ 90％乙醇→95％乙醇→乙醚→ 干燥保存 ②湿态保存（经常使用）： 水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。
7、检测和合并收集
（1）洗脱后检测； （2）洗脱检测同步
溶菌酶的分离纯化：溶菌酶和牛血清白蛋白的混 合液中分离 牛血清白蛋白：分子量为66kDa 溶菌酶：分子量为14kDa
蛋白质在280nm有紫外吸收。
时间 吸光 度 0min 0 1min 0 2min 42 3min 90 4min 44 5min 0 6min 36 7min 89 8min 40 9min 0
2、凝胶特性参数
（1）、排阻极限 指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的分 子量 如：Sephadex G-50的排阻极限：30kDa （2）、分级范围 能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分 离的溶质的分子量范围 如： Sephadex G-50的分级范围：1.5-30Da
（四）、操作方法
以溶菌酶和牛血清白蛋白 的分离为例
1000-5000Da 1.5-30kDa 3-80kDa
SephadexG15
SephadexG25 SephadexG50 SephadexG75
（2）干胶量的计算 根据所需凝胶体积，估计所需干胶量： 一般，Sephadex吸水后的凝胶体积约 为其吸水量的两倍 如：Sephadex G-50 1克凝胶膨胀时吸水5克—5ml 1克凝胶膨胀吸水后的凝胶体积约10ml
②、价数相同时，原子序数越高，结合力 越大 Li+ < Na+ < K+ < Rb+ < Cs+
分配系数差异越大， 分离效果越理相。
三、基本特点
① 分离效率高（分离纯化技术中最高的）； ② 应用范围广； ③ 选择性强； ④ 设备简单，操作方便，特别适于不稳定的 大分子有机化合物。
四、缺点
处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
五、色谱法的分类
按照固定相的形状分类 柱色谱法√ 纸色谱法 薄层色谱法 气相色谱法 液相色谱法
色 谱 法 的 分 类
按照流动相的相态分类
按照分离机理分类
凝胶色谱法 离子交换色谱法 吸附色谱法 亲和色谱法
六、凝胶色谱
又称为凝胶过滤层析、分子筛层析、排阻层析等
（一）原理
凝胶：一种不带电荷的具有三维 空间的多孔网状结构的物质，凝 胶的每个颗粒的细微结构就如一 个筛子。
孔径大小有一定分布范围：Φmin~Φmax
（3）凝胶的预处理
Sephadex G50干粉：蒸馏水溶胀24h，或沸水浴3h。
附注：溶胀过程中不要过分搅拌，以防颗粒破碎； 溶胀后用倾泻法将不容易沉下的较细颗粒除去。
2、层析柱的选择
①、层析柱：玻璃管或有机玻璃管 直径：1-5cm 高度：＜100cm ②、分离度取决于柱高，与层析柱的直径大小无关
3、离子交换树脂的基本性质
（1）含可交换离子 （2）不同化合物与离子交换树脂的结合力不同 （3）吸附的化合物可以通过改变条件，被洗脱 下来
（二）、原理 以离子交换剂为固定相，以含有特定离子的 溶液为流动相，利用离子交换剂上的平衡离子与 溶液中离子发生交换作用，由于不同的离子交换 能力不一样，带分离的各种离子在层析柱中随流 动相的移动速度也不一样，而将混合物中的不同 带电离子分离。 或：依据生物大分子与离子交换剂的结合力不同 而进行分离纯化。 结合力：相反离子间的静电引力。
④、8种型号：G-10，G-15，G-25，G-50， G-75，G-100，G-150，和G-200
（2）、琼脂糖凝胶 （Sepharose，Bio-Gel-A） 为半乳糖的线性多聚体，依靠糖链之间的次级 链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼 脂糖的浓度。 使用条件：0-40℃，pH4-9使用 优点：分子量的使用范围宽 缺点：适用于分离分子量差距较大的分子，即分辨 率不高。
六、凝胶过滤层析
七、离子交换色谱
（一）离子交换介质的性质
1、固定相（离子交换介质）的组成
①高分子聚合物基质：树脂、葡聚糖、琼脂 糖、纤维素等
②电荷基团（功能基团） ③平衡离子
2、离子交换剂的种类
①阳离子交换剂：平衡离子带正电，能与阳离子发 生交换作用 ②阴离子交换剂：平衡离子带负电，能与阴离子发 生交换作用
第七章 常见色谱分离技术
色谱又称层析 1903，俄国植物学家Tsweet分离植物色素时使用。
一、概念
色谱法是利用不同物质在互不相溶的两相中 具有不同的分配系数，并通过两相不断的相 对运动而实现分离的方法。
固定相：碳酸钙 流动相：石油醚
二、原理
根据混合物在互不相溶的两相之间分配系数 的差异，引起移动速度的不同而进行分离。
生物胶 P-2 分离范围（分子量） 100------1,800Da
P-4
P-6 P-10 P-30 P-60 P-100 P-150 P-200 P-300
800------4,000Da
1,000------6,000Da 1,500------20,000Da 2,500------40,000Da 10,000------60,000Da 5,000------100,000Da 15,000------150,000Da 30,000------200,000Da 60,000------400,000Da
6、洗脱和分步收集
分步收集洗脱液，并对每一馏分做定性、定量测定。
（四）、操作方法
以溶菌酶和牛血清白蛋白 的分离为例
牛血清白蛋白：分子 量为66kDa 溶菌酶：分子量为 14kDa
1、凝胶的预处理
（1）凝胶种类的选择
（2）干胶量的计算
（3）凝胶的预处理
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2、层析柱的选择
3、装柱
4、平衡
5、加样
6、洗脱和分步收集
外水体积（Vo）的测定：蓝色葡聚糖2000（全排阻）的洗脱体积；
内水体积（Vi）的测定：黄色铬酸钾 （Φ分子＜Φmin）的洗脱体积减去外水 体积（Vi = Vo - Ve）； 柱床体积（Vt）的测定：
D为柱子直径，h为柱床高度
（三）凝胶过滤介质
1、凝胶的种类及性质 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 （1）、葡聚糖凝胶（Sephadex） ①、单体：葡萄糖 ②、交联剂：环氧氯丙烷
分族（组）分离（分子量相差悬殊）：短柱 20-30cm 分级分离（分子量相差不大）：长柱 100cm左右 常用凝胶柱：50×2.5cm， 10×2.5cm
3、装柱
重力沉降法或加压法装柱。 （1）将层析柱垂直固定； （2）向柱内加入约1/4至1/3体积的 0.6%NaCI溶液； （3）将一细玻璃棒伸入柱内，顺着玻璃棒 缓慢加入混匀的凝胶溶液； （4）待底部凝胶沉积约1cm高时，打开出 口，继续加入凝胶至理想高度。
孔径大小有一定分布范围： Φmin~Φmax
Φ分子>Φmax：全排阻 Φ分子＜Φmin：能进入凝胶的 全部空隙
（二）凝胶色谱理论
外水体积（Vo）：凝胶柱中凝胶颗粒周 围空间的体积； 内水体积（Vi）：凝胶颗粒中孔穴的体 积； 柱床体积（Vt）：凝胶柱所能容纳的总 体积； 洗脱体积（Ve）：将样品中某一组分洗 脱下来所需洗脱液的体积。它包括自加 入样品时算起，到组分最大浓度出现时 所流出的体积，一般介于Vo和Vt之间；
加样体积根据分离要求确定：一般为整个 柱体积的1%-5%。 （1）、分级分离：1-4% （2）、分族分离：10% （3）、脱盐：20-30%
加样量对分辨率的影响
1、加样量少时，A，B两 种物质能完全分开；
2、加样量适中时，A，B 两种物质刚刚分开； 3、加样量太大时，A，B 两种物质部分分开； 样品浓度范围一般在：0.01%至0.5%。
牛血清白蛋白：分子 量为66kDa 溶菌酶：分子量为 14kDa
1、凝胶的预处理
（1）凝胶种类的选择： Sephadex
①混合物的分离程度主要取决于凝胶内部微孔 的孔径和混合物相对分子量的分布范围。
②凝胶的颗粒粗细：细颗粒分离效果好
厂家：Amersham Pharmacia Biotech 安玛西亚公司
（3）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P） ①、单体：丙烯酰胺 ②、交联剂：甲叉双丙烯酰胺 ③ 、型号：从P-2至P-300共10种， 如：Bio-Gel P-2， 2再乘1000就相当于该凝胶的 排阻限度，即该凝胶的排阻限度为2000Da。
④、缺点：不耐酸 （pH2-11使用）
聚丙烯酰胺凝胶
R
X+
+ + +
Y-
+ +
+
A-
R X- Y+A+ - + + - + + - + + - + + - + + - + +
阳离子交换剂 X+或X- ：电荷基团
阴离子交换剂 R：基质
Y+或Y-：平衡离子
A+或A-：溶液中的离子基团
离子交换剂的电荷基团对不同的离 子有不同的结合力，一般来讲： ①、离子价数越高，结合力越大 Na+ < Ca2+ < Al3+ < Si4+