复方盐酸二甲双胍片在人体内药物动力学和生物等效性研究

复方盐酸二甲双胍片在人体内药物动力学和生物等效性研究

曲　斌　杭太俊　宋　敏　葛晓明　吴晓鸾

中国药科大学　(南京　210009)

摘　要:目的　建立人血浆中盐酸二甲双胍的反相离子对高效液相色谱和格列本脲的液相色谱2质谱测定方法,研究复方盐酸二甲双胍片(盐酸二甲双胍250mg/格列本脲1125mg×2片)相对于联合使用的盐酸二甲双胍片(500mg)和格列本脲片(215mg)在男性健康志愿者体内的药物动力学行为,评价其生物利用度和生物等效性。方法　采用双交叉随机实验设计:20名受试者交叉口服复方盐酸二甲双胍片2片或口服盐酸二甲双胍片与格列本脲片各1片,服药后于015、110、115、210、215、310、315、410、510、610、810、12、24、36h分别取血,分离血浆,分别依法测定盐酸二甲双胍和格列本脲的血药浓度。结果　测得口服复方盐酸二甲双胍片或联合使用盐酸二甲双胍片与格列本脲片后,盐酸二甲双胍的达峰时间分别为(210±017)h和(211±019)h,峰浓度分别为(140214±34912)μg?L-1和(132917±31514)μg?L-1,消除半衰期分别为(3184±0161)h和(4126±0196) h,AUC0224分别为(729217±196715)μg?L-1和(741612±184319)μg?h?L-1;格列本脲的达峰时间分别为(311±019)h和(310±018)h,峰浓度(7117±2217)μg?L-1和(7013±2017)μg?L-1,消除半衰期分别为(5105±2101)h和(4178±1164)h,AUC0224分别为(36716±16817)μg?L-1和(35216±14417)μg?h?L-1;以联合服用等剂量的盐酸二甲双胍片与格列本脲片为参比,以AUC0224计算得复方盐酸二甲双胍片之盐酸二甲双胍和格列本脲的相对生物利用度,分别为10111%±2815%和12317%±8219%。结论　建立的分析方法准确灵敏,测得数据可靠。统计学分析表明复方盐酸二甲双胍片与联合使用盐酸二甲双胍片和格列本脲片显生物等效。

关键词:盐酸二甲双胍;格列本脲;HP LC/ESI2MS;HP LC;药物动力学;生物等效性

中图分类号　R969.1 文献标识码　A 文章编号　10072306(2004)02204206

Ph arm acokinetics and B ioequiv alence o f C ompou nd M etformin H yd roch lorid e T ablets in Chinese H ealthy Male V olunteers

Q u Bin,H ang T ai2jun,Song Min,G e Xiao2ming,Wu Xiao2luan

Department o f Pharmaceutical Analysis,China Pharmaceutical Univer sity　(Nanjing　210009)

Abstract:Aim　T o establish an ion2pair HP LC method for the determination of metformin hydrochloride and a HP LC/ESI2MS method for the determination of glibenclamide in human plasma,and to investigate the pharmacokinetics and bioequivalence of com pound metformin hy2 drochloride tablets(tw o tablets,metformin hydrochloride/glibenclamide=250mg/1125mg)versus equivalent doses of co2administered one met2 formin hydrochloride tablet(500mg)and one glibenclamide tablet(215mg)in Chinese male healthy v olunteers1Method　A randomized tw o2 way cross over design was conducted in20v olunteers1Each subject was randomized to receive either tw o com pound or co2administered tablets1 Blood sam ples were collected prior at015,110,115,210,215,310,315,410,510,610,810,12,24and36h after dosing using test tubes and centrifuged at1000×g for10min to separate the plasma1And the plasma sam ples were analyzed for the concentrations of metformin hydrochlo2 ride or glibenclamide respectively1R esult　The main pharmacokinetic parameters t max and C max,t1/2,AUC0224after po of com pound or co2ad2 ministered tablets were(210±017)and(211±019)h,(140214±34912)and(132917±31514)μg?L-1,(3184±0161)and(4126±0196) h,(729217±196715)and(741612±184319)μg?h?L-1for metformin hydrochloride;and(311±019)and(310±018)h,(7116±2217) and(7013±2017)μg?L-1,(5105±2101)and(4178±1164)h,(36716±16817)and(35216±14417)μg?h?L-1for glibenclamide respec2 tively1The relative bioavailability of metformin hydrochloride and glibenclamide was10111%±2815%and12317%±8219%respectively1 Conclusion　The assay was shown to be sensitive,accurate,and the results were reliable1The com pound metformin hydrochloride tablets were bioequivalent to equivalent doses of co2administered metformin hydrochloride and glibenclamide tablets1

K ey w ords:Metformin hydrochloride;G libenclamide;HP LC/ESI2MS;HP LC;Pharmacokinetics;Bioequivalence

?

?

4

复方盐酸二甲双胍片是由格列本脲(G liben2 clamide)和盐酸二甲双胍(Metformin Hydrochloride)组成的治疗糖尿病的复方制剂。格列本脲通过刺激胰腺上胰岛中的β细胞,促进胰岛素释放,使血糖降低;盐酸二甲双胍可以改善Ⅱ型糖尿病患者对葡萄糖的耐受性,降低基础和饭后血糖水平,减少肝糖元的生成,抑制葡萄糖在肠中的吸收,通过加强周围组织对葡萄糖的提取和利用,提高胰岛素的敏感性而降低血糖。两类药物作用原理不同,机制互补,增强降糖效果,减少副作用,可以更好地改善Ⅱ型糖尿病患者对血糖的控制[1]。

因盐酸二甲双胍的极性强,易溶于水,不易溶于有机溶剂,有关盐酸二甲双胍血药浓度的测定,Julie K eal等[2]采用溴麝草酚蓝为离子对,经乙醚2二氯甲烷萃取后,再用T BAH反提取,方法繁琐,不易重现; Ole Vesterquist等[3]用超滤和柱切换技术; R1Huupponen等[4]报道了SPE技术,操作复杂并且费时;因盐酸二甲双胍与血浆蛋白结合率低,近年来有的学者采用乙腈[5,6]、高氯酸[7]作为沉淀剂,对盐酸二甲双胍血药浓度的测定进行了研究。但使用乙腈会产生样品的稀释效应,在一定程度上降低测定的灵敏度。

采用紫外[8]、荧光[9]或质谱检测器[10]测定格列本脲在生物体液中浓度的HP LC方法已有报道。但有的方法并不直接适用于药物动力学研究,有的方法用于口服更高剂量格列本脲的研究。

我们建立了相对简单、专属和灵敏的离子对高效液相色谱法,测定人血浆中盐酸二甲双胍浓度和具有高度灵敏性和选择性的液相色谱2质谱联用法测定格列本脲浓度,成功地用于复方盐酸二甲双胍片在男性健康志愿者体内的药物动力学和生物利用度研究。

1　材料和方法

111　仪　器

安捷伦1100液相色谱(LC/VW D)和安捷伦1100液相色谱2质谱联用系统(LC/MS D)。

112　试剂与试药

盐酸二甲双胍、格列本脲和格列吡嗪(作为内标)对照品购自中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯;乙酸乙酯、二氯甲烷、高氯酸、磷酸二氢钾均为市售分析纯;十二烷基磺酸钠为化学纯;双蒸水由本实验室自制。

受试制剂:复方盐酸二甲双胍片(浙江震元制药有限公司,每片含盐酸二甲双胍250mg和格列本脲1125mg,批号021217);

参比制剂:盐酸二甲双胍片(中美合资上海施贵宝制药有限公司,500mg/片,批号4973);格列本脲片(上海信谊药业有限公司,215mg/片,批号020601)

113　数据分析

本研究所得的血药浓度数据采用中国药理学会药理专业委员会编制的3P97药物动力学程序进行模型拟合,以非房室依赖型方法估算受试者的主要药物动力学参数,C max和t max为实测值,AUC0224为实测血药浓度,经梯形法计算。实验数据采用均数±标准差(x±s)表示。

2　方法和结果

211　实验方案

本试验为开放、随机、双交叉试验,试验间隔期为1周。20名健康男性受试者,年龄(22124±0177)岁,身高(16914±912)cm,体重(68117±8154)kg,体重偏差不超过标准体重的10%,体质指数(BMI) (2117±2169)kg?m-2。试验前14天内筛选,全面体检及实验室检查(包括血、尿常规,肝、肾功能等)。受试前1周内未吸烟、饮酒,受试前1月内未使用任何药物。受试者在试验期间禁烟、酒及任何含醇食品。20名受试者在试验前均已了解试验的目的、内容和要求,并在自愿的基础上签署知情同意书。在试验日受试者随机编号,分别口服复方盐酸二甲双胍片2片,或盐酸二甲双胍片1片和格列本脲片1片;用250ml饮用水送服,服药后2h内禁水,4h内禁食,4h后给统一标准餐;1周后交叉给予另一药物。试验经伦理委员会同意后进行。

两组分别于给药前和给药后015、110、115、210、215、310、315、410、510、610、810、12、24、36h肘静脉抽血5ml,置于含抗凝剂的试管内,1000×g离心10min,血浆转移至塑料试管中置-20℃冰箱保存至分析。

212　盐酸二甲双胍的测定

21211　色谱条件　色谱柱:Lichrospher C18(5μ, 416mm i1d1×250mm);流动相:甲醇-01005m ol/L 磷酸二氢钾溶液(含01001m ol/L十二烷基磺酸钠,用氢氧化钠溶液调节pH512)40∶60(v/v);柱温35℃;检测波长232nm;流速1ml?min-1。

21212　血浆样品处理方法　取血浆015ml置210ml E ppendorf管中,加入35%高氯酸30μl,涡旋1

?

5

?

min ,12000×g 高速离心5min ,将上清夜转移至另

一E ppendorf 管中,加100μl 二氯甲烷,涡旋1min ,

高速离心5min ,取上清液20μl 进样分析,外标法定

量(见图1)

。

图1　典型色谱图

(A )空白血浆;(B )空白血浆加入1000μg ?L -1盐酸二甲双胍;

(C )一受试者口服500mg 盐酸二甲双胍后215h 的血样,其浓度为1240μg ?L -1

图2　HP LC/ESI 2MS 色谱图

(A )空白血浆;(B )空白血浆加入格列吡嗪(内标)和格列本脲;(C )一受试者口服215mg 格列本脲后2h 的血样。

1:格列吡嗪,[M 2H]-m/z 444;2:格列本脲,[M 2H]-m/z 492

21213　方法学考察　取空白血浆,精密加入盐酸二甲双胍对照品溶液适量,配制成浓度分别为20、40、

100、200、400、1000、2000μg ?L -1的血浆样本。按上述方法处理后,分别进样20μl ,测定峰面积。将峰

面积(A )对样品浓度(X ,μg ?L -1)进行线性回归,得回归方程:A =010209X -010191,r =01998。结果表

明,盐酸二甲双胍在20～2000μg ?L -1范围内线性关系良好,最低定量限20μg ?L -1。

取浓度为40、400、2000μg ?L -1的血浆样本,分别于1d 内5个不同时间点及不同日内连续测定5d ,由测得浓度计算相对标准偏差(RSD ),结果见

表1。RSD 均在1010%以内,测定方法可靠。

取浓度为40、400、2000μg ?L -1的血浆样本各5份,按样品处理方法处理后,在上述色谱条件下,分别进样20μl ,记录峰面积(As )。以纯水代替血浆和高氯酸,配制盐酸二甲双胍浓度为40、400、2000μg ?L -1的样品,经同样的样品处理分析,记录峰面积(Ar )。绝对回收率为Rec %=As/Ar ×100%,结果

见表1。血浆的绝对回收率大于80%,符合分析测定的要求。

?

6?

表1　盐酸二甲双胍血浆回收率和精密度分析

(n=5,x±s)

C oncentration (μg?L-1)Recovery

(%)

Precision(RSD)/%

Intraday Interday

408317±1013812918

4008514±211117313

20008418±319210410

213　格列本脲的测定

21311　LC/MS系统　色谱柱:Lichrospher C18(5μ, 416mm i1d1×250mm);流动相:甲醇2015%冰醋酸75∶25(v/v);柱温:25℃;API2ESI选择性负离子监测:格列本脲[M2H]-,m/z=492,格列吡嗪[M2 H]-,m/z=444;流速:1ml?min-1;传输电压、干燥氮气流速、干燥气温度、雾化器压力和毛细管电压分别为120V、10L?min-1、350℃、40psi和4000V。21312　血浆样品处理　精密吸取血浆015ml置10 ml具塞离心管中,精密加入格列吡嗪内标溶液25μl (210μg?ml-1),加110m ol?L-1HCl0120ml、乙酸乙酯510ml,涡旋混匀3min,1000r/min离心10min,分取上清液410ml,于37℃水浴中氮气吹干。残留物用150μl HP LC/MS D测定,用流动相涡旋溶解,高速离心后,量取上清液50μl作HP LC/MS D分析(见图2)。

21313　方法学考察　血浆内源性物质不干扰色谱分析测定,格列本脲的保留时间约为418min;内标格列吡嗪的保留时间约为317min。格列本脲血浆浓度在110～200μg?L-1范围,色谱响应线性关系良好(r>01998),并测得血浆中格列本脲最低定量限约为110μg?L-1。高中低浓度分析测定的精密度良好(RSD%<1010),绝对回收率均>80%(见表2)。表2　格列本脲血浆回收率和精密度分析　(n=5,x±s)

C oncentration (μg?L-1)Recovery

(%)

Precision(RSD)%

Intraday Interday

48219±915317915

408710±616517116 2008010±414612213

214　药物动力学分析

由于36h时大多数受试者的血浆样品中盐酸二甲双胍和格列本脲血药浓度均低于本研究测定方法的最低定量限,故该时间点的血浆药物浓度不用于药物动力学参数计算。

20名健康受试者单剂量口服复方盐酸二甲双胍片2片(每片含盐酸二甲双胍250mg与格列本脲1125mg)、或联合服用盐酸二甲双胍片(500mg/片)与格列本脲片(215mg/片)各1片后,测得20名健康受试者盐酸二甲双胍和格列本脲血药浓度2时间曲线分别见图3和图4,平均血药浓度2时间见表3,主要药物动力学参数分别见表4和表5

。

图3　20名男性志愿者单剂量口服500mg盐酸二甲双胍后盐酸二甲双胍的平均血药浓度2时间曲线

—◆—复方盐酸二甲双胍片;

—□—

同时口服盐酸二甲双胍片和格列本脲片

图4　20名男性志愿者单剂量口服215mg格列本脲后格列本脲的平均血药浓度2时间曲线

—◆—复方盐酸二甲双胍片;

—○—同时口服盐酸二甲双胍片和格列本脲片

表3　20名男性健康志愿者单剂量口服2片复方盐酸二甲双胍片或同时口服1片盐酸二甲双胍片和1片格列本脲片后的盐酸二甲双胍和格列本脲平均血药浓度(μg?L-1)2时间(h)数据　(x±s)

t (h)

C om pound metform in hydrochloride tablets

M etform in hydrochloride G libenclam ide

C o2adm inistered metform in hydrochloride and glibenclam ide tablets

M etform in hydrochloride G libenclam ide

01567416±26218714±71270811±1274171315±1316 110101918±387122314±141498613±348152917±1911 115116318±337184118±2110108118±209153917±2315

?

7

?

(续表3)

t (h)

C om pound metform in hydrochloride tablets

M etform in hydrochloride G libenclam ide

C o2adm inistered metform in hydrochloride and glibenclam ide tablets

M etform in hydrochloride G libenclam ide

210116413±342164316±2212116414±220194517±2510 215113819±362155114±1818110714±258145119±2216 310105416±408156218±2117108716±309105610±2211 31597116±388125912±241599214±318155616±2416 41075616±185195217±251581414±207114911±2413 51062115±237193316±221359317±194192918±1911 61045212±161102413±171849118±219102410±1517 81028816±111161417±101328510±115191319±914 1210518±4610714±61011316±5314617±318 241919±914116±1152414±1212114±111

表4　20名志愿者单剂量口服500mg盐酸二甲双胍后的

药物动力学参数

Parameters C om pound tablets

(2×250mg/

1125mg)

C o2adm inistered

metform in hydrochloride

(1×500mg)and

glibenclam ide(215mg)tablets

K a/h-111561126

t1/2/h3184±01614126±0196

C max/μg?L-1140214±34912132917±31514

t max/h210±017211±019 MRT/h5139±01485172±0196 AUC0224/μg?h?L-1729217±196715741612±184319 C L/L?h-169±4370±21

表5　20名志愿者单剂量口服215mg格列本脲后的药物动力学参数

Parameters C om pound tablets

(2×250mg/

1125mg)

C o2adm inistered

metform in hydrochloride

(1×500mg)and

glibenclam ide(215mg)tablets

K a/h-101790183

t1/2/h5105±21014178±1164

C max/μg?L-17116±22177013±2016

t max/h311±019310±018

MRT/h6192±21086154±1123

AUC0224/μg?h?L-136716±1681735216±14417

C L/L?h-111±610±5

盐酸二甲双胍和格列本脲的AUC和C max经对数转换后方差分析检验,t max经非参数检验(Wilcox on 符号秩检验),结果表明,在α=0105时均无显著性差异。与复方盐酸二甲双胍片相应的盐酸二甲双胍和格列本脲的AUC的90%置信限分别为8715%～10814%和8617%～11911%,均落在参比片的80%～125%范围内;C max的90%置信限分别为9316%～11711%和8814%～11612%,均落在参比片的70%～143%范围内。3　讨　论

盐酸二甲双胍的极性较大,难溶于有机溶剂,不能用有机溶剂直接从生物样品中萃取出来。因其血浆蛋白结合率低,可采用高氯酸沉淀蛋白质的方法处理。实验表明,015ml血浆可用30μl35%高氯酸沉淀,30μl的沉淀用量明显减少对血浆的稀释效应,提高检测灵敏度。研究发现,高氯酸沉淀后的上清液中仍有少量内源性物质,干扰盐酸二甲双胍的测定,特别是低浓度点的检测。估计可能是未被高氯酸沉淀的脂溶性物质,因此,采用二氯甲烷萃取脱脂,盐酸二甲双胍因其极性大,在脱脂过程中,很少有损失,结果表明,脱脂比不脱脂后的色谱图基线平稳,干扰明显减少。

研究建立的LC/ESI2MS方法,分析了血浆中格列本脲的浓度,通过选择性负离子监测,血浆的干扰明显减少,整个分析在6min内完成。本方法的最低定量限为1μg?L-1,其灵敏度足以测定口服215mg格列本脲后的血药浓度;另外,样品提取过程简单稳定。

4　结　论

研究分别建立了灵敏、专属的离子对高效液相色谱测定血浆中盐酸二甲双胍和高效液相色谱2质谱分析血浆中格列本脲浓度的方法,适宜于各自的临床药物监测。

药物动力学研究表明,口服复方盐酸二甲双胍片与联合服用等剂量的盐酸二甲双胍片和格列本脲片相比较,盐酸二甲双胍和格列本脲的体内过程均显生物等效。

格列本脲的血药浓度2时间曲线显示,虽然经对数转换的C max和AUC,经双单侧t检验表明,两种

?

8

?

服药方式格列本脲生物等效,但其个体间和周期间差异较大,这可能是由于格列本脲的水溶性差,以及其微粉化程度对吸收的影响造成的。

参考文献

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Anal Chem,2000,72:334223348.

(收稿日期:2004202226)

美洛昔康片剂与胶囊剂溶出度的比较

费　燕1　朱　华1　贾玲昌1　冯兆松2

1扬州大学临床医学院　(扬州　225001)　2江苏大学药学院　(镇江　212000)

摘　要:目的　测定5个不同厂家的美洛昔康片剂与胶囊剂的溶出度,考察产品质量。方法　采用紫外分光光度法测定美洛昔康片剂与胶囊剂的溶出度。结果　5个不同厂家的美洛昔康片剂及胶囊剂45min内均溶出70%以上,溶出度参数T50、T d、T80、m及溶出速率常数K r均存在显著性差异(P<0101)。结论　不同厂家产品的内在质量存在差异,提示临床用药时应加以注意。

关键词:美洛昔康;溶出度;紫外分光光度法

中图分类号　R944.2 文献标识码　A 文章编号　10072306(2004)02209203

Study on the Dissolution R ate of Meloxicam T ablets and C apsules in vitro

Fei Yan1,Zhu H ua1,Jia Ling2chang1,Feng zhao2song2

1Clinical Medical College o f Yangzhou Univer sity　(Yangzhou　225001);

2School o f Pharmacy,Jiangsu Univer sity　(Zhenjiang　212000)

Abstract:Aim　T o determine the diss olution of meloxicam tablets and capsules from5domestic factorys1Method　The diss olution were determined with UV spectrophotometry in vitro1R esult　The results indicated that all the sam ples were released over70%in45minutes1Very

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