第八章 新品种培育

多倍体动植物鉴定
直接法：染色体计数、DNA含量测定等。
染色体计数是鉴定多倍体倍性的一个准确的 直接方法，但比较费时。
细胞 DNA 含量可以用流式细胞仪测定，细 胞 DNA 含量是倍性鉴定的另一个有效的直 接方法。
间接法：核体积测量、形态学检查等。
1、核体积测量：细胞核大小与染色体数目成比例增加，而且为
化学药物诱导多倍体育种的方法---秋水仙素为例
处理部位: 通常以植物茎端分生组织或发育期的幼胚为材料， 花分生组织也可作为处理对象。
处理方式：水溶液；
处理方法：以浸渍法、涂抹法比较常用。 药剂浓度：一般0.01%—0.5%，0.2%常用； 处理时间：一般不少于24h； 处理温度：18—25℃ 。温度较高成功的可能性较大。
于细胞培养范畴。
1. 材料准备：选择未开放的花蕾。花蕾经灭菌后，在无菌条件
下，剥取花药，接种在培养基上。 •自然释放法：把花药接种在聚蔗糖的液体培养基上，花药漂浮 于液体表面，培养1-7天，花药开裂，花粉散落，过滤收集。 • 机械分离法：包含分离、过筛和清洗三个步骤。 1、分离：花药放在适当浓度的蔗糖溶液上，轻压花药挤出花粉 2、过筛：花药和花粉混合液经过一定滤网孔径过滤，分离出花 粉
（STS）、限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）、随机扩增的
多态性（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）等
小麦单倍体育种
花 粉 获 得
花 粉 制 备 与 培 养
愈 伤 组 织 培 养
移 栽
染 色 体 加 倍
可 育 植 株
n=21
2n=42
+ 多倍体(polyploid)是指每个体细胞中含有三个或更多染色体
正位重复
重复
倒位重复
染色体数目变异分整倍体和非整倍体两种。
整倍体：染色体数目以染色体组数目成倍增加或减少，单倍体，三 倍体，多倍体等。以整倍体染色体数目变化产生的变异会产生多倍 体和单倍体生物。
非整倍体：染色体组内的个别染色体数目增减，形成单体、三体等。
在真核生物的细胞核中，若染色体数目发生变异，即增减一条或几 条，则染色体数目不是整倍体。如二倍体缺一条染色体是单体(2n1)，二倍体多一条染色体是三体(2n+1)。
+ 原生质体在离体培养条件下非常容易受到外界因素影
响而发生遗传性状改变，染色体数目和结构的变异、
基因的突变等都导致原生质体再生后产生的植株的性
状不同于母体。
+ 染色体变异包含染色体数目变异与结构变异。 + 通常原生质体再生植株时染色体倍性的改变（染色体
数目变异）是常见的现象，比如多倍体、单倍体的产
中间缺失(interstitial deletion)
+ 倒位(inversion，inv)：染色体上某一区段连同它带有的顺序发
生180度倒转。 4p14 4q13
4q24
4q21
臂内倒位(paracentric inversion)
臂间倒位(pericentric inversion)
+ 重复(duplication，dup)：一条染色体上增加了相同的某个区段。
白质电泳方法鉴定倍性时也要慎重。
+ 胚胎嵌合是将2个胚胎（同种或异种动物胚胎）合并，共同发育成1个混合胚
胎，即“嵌合胚胎”，然后将这个胚胎移植给受体，让其妊娠产仔。如果产
下来的幼仔具有以上2种动物胚胎的细胞，则称其为“嵌合体动物”。
+ 嵌合体的动物最早出现在希腊神话中，它是指狮头、羊身、龙尾的怪物。 + 中国的“龙”：“龙角似鹿、头似驼、眼似鬼、项似蛇、腹似蜃(shèn)、鳞
单倍体产生的途径
单倍体产生途径包括体内发生和离体诱导两个途径。 体内发生途径即从胚囊内产生单倍体，包括： 1、自发产生：与多胚现象常有联系，如油菜和亚麻的双胚苗中
经常出现单倍体，可能由温度骤变或异种、异属的花粉刺激引起。
2、假受精：雌配子经划分或雄核刺激后未受精而产生的单倍体。 3、雌核发育或孤雌生殖：精核进入卵细胞后未与卵核融合而退 化，卵核未经受精而单独发育成单倍体。 人工诱导单倍体的方法主要是产生雌核发育过程，包括： 1、用物理或化学方法使精子遗传物质的失活。 2、阻止细胞第一次有丝分裂或第二极体外排。
• 合子的染色体加倍
1. 核内复制：在两次细胞分裂之间，染色体复制了一次以上。 2. 核内有丝分裂：在细胞分裂的前中期，核膜未能破裂，纺锤体 不能形成，在后期不能出现染色单体的分离和胞质分裂，从而
造成染色体数目的加倍。
23X
23X
23X
23X 23X
23X 23X
69，XYY 69，XXY
双雄受精
物理诱导方法
主要包括温度激变（温度休克法）、机械创伤、辐射、水静压
和高盐高碱法：
温度休克法包括冷休克法（0—5℃ ）和热休克法（30℃左右） 两种，即用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍 体或四倍体的方法。 温度休克法的关键是能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二 极体的排出。必须考虑温度处理的开始时间(TA)、处理持续时间 (D)和处理温度(T) 。
3、清洗：通过离心的方式纯化花粉
2、植株再生：花药和花粉接种到培养基后，在适宜的条件下，
经过一段时间的培养，小孢子发生脱分化，改变原来发育途径，
通过器官发生型或胚状体发生型再生成单倍体植株。 器官发生型：即从细胞或愈伤组织培养通过不定芽形成植株。 胚状体发生型：从细胞或愈伤组织通过胚状体（等同于植物 种子的胚的结构）途径发育成植株。 A：下胚轴表面出现胚状体；
细胞松弛素B(cytochchalasin B)能抑制肌动蛋白聚合微丝，从
而抑制细胞质分裂。 秋水仙素(colchicine)可以抑制细胞分裂中纺锤丝的形成，因 而抑制有丝分裂，是最为广泛的植物染色体加倍诱导剂。 秋水仙素是一种生物碱。因最初从百合科植物秋水仙属植物 （Colchicum autumnale）中提取出来，故名。分子式 C22H25O6N·12H2O。易溶于水、乙醇和氯仿。 其它药物还有麻醉剂，如N2O和聚乙二醇等。
对于植物而言，常采用两种方法：
杂交法：先获得同源四倍体，再与二倍体个体杂交，便获得
三倍体植株。 胚乳培养法：
被子植物的胚乳是3个单倍体核融合而成
对于动物而言主要指远源杂交：
Rasch等（1965）年首次证明了三倍体脊椎动物可以通过四倍
体个体与二倍体个体杂交产生。 雌性草鱼（2n=48）与雄性三角鲂（ 2n=48）杂交获得子一代 染色体数目为72的草鲂杂种三倍体，其中草鱼提供了二倍数目 的染色体（48），三角鲂提供了单倍数目的染色体（24）。
温度休克法的优点是温度休克法廉价、易操作，是诱导动物
细胞多倍体化的常用手段。
水静压法采用较高的水静压抑制第二极体的放出或第一次卵
裂来产生多倍体。 水静压的优点是诱导率高、处理时间短、对受精卵损伤小、 成活率高。 水静压法的缺点是需要专门的设备——水压机，成本较高， 其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产 的。
组的个体，常见有三、四、五、六和八倍体。
+ 同源多倍体：加倍的染色体来自于同一物种或原有染色体组的
基础上加倍而成。
+ 异源多倍体：加倍的染色体组来源于不同的物种。
多倍体产生的途径
•
未减数配子的结合
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1. 双雄受精：一个正常的卵子同时与两个正常的精子发生受精。 2. 双雌受精：一个二倍体的异常卵子与一个正常的精子发生受精， 从而产生一个三倍体的合子，称为双雌受精。
多倍体育种方法
多倍体育种包括自然多倍体的挖掘和人工多倍体的诱导，自然多 倍体数量毕竟有限，人工诱导多倍体育种是更好的选择。 人工诱导多倍体的方法有：
1、化学方法
2、物理方法 温度休克法 水静压法 3、生物方法 杂交法 胚乳培养法
化学诱导方法
一些化学物质可以阻止细胞分裂而产生多倍体，包括：
重点内容：
什么是单倍体？ 什么是单倍体育种？ 单倍体育种的方法或途径？
单倍体的特点及应用？
什么是多倍体？ 什么是多倍体育种？ 多倍体育种的方法或途径？ 多倍体的特点及应用？
单倍体育种
•单倍体是细胞中含有正常体细胞一半染色体数的个体，即具有
配子染色体组的个体。 •一般比较矮小纤弱。 • 由于减数分裂时同源染色体联会发生紊乱，因此很难形成具 有完整一套染色体组的配子，而具有高度不育性。 • 单倍体染色体上每个基因都能表现相应的性状，极易发生突 变，是进行染色体遗传分析的理想材料。 • 通过人工方法使单倍体的染色体加倍就可以获得纯合二倍体， 具有可育性。
69，XXX
69，XXY
69，XXX
双雌受精
正常染色体
双倍染色体
多倍体植物的特点
1、巨大性
多倍体草莓
野生草莓
二倍体和四倍体的葡萄
2、育性低
• 同源多倍体在减数分裂时同源染色体间配对不正常，联会发 生紊乱，不能形成正常的配子，因而表现出高度不育性，结实 率低，特别是奇数倍的多倍体。 • 异源多倍体是可育的，来自母本的染色体在减数分裂时自行
维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例 增加。因此组成多倍体有机体的细胞及细胞核通常要比二倍体 大一些。但多倍体的器官或身体并不一定都比二倍体大。 2、蛋白质电泳也可用来鉴定多倍体倍性。Balsano等(1972)用 血清蛋白电泳图差异来辨别二倍体与三倍体。但二倍体与三倍 体的关东银鲫在血清蛋白上并没有明显的差异。这说明适用蛋
配对，表现为自交亲和，结实率较同源多倍体高。
3、抗逆性强
超高产人工三倍体新桑品种嘉陵20
号：体细胞较大，叶肉厚，叶色深， 叶质较好，抗寒性增强。
4、营养成份高 大麦同源四倍体籽粒蛋白质含量比二倍体原种增加10-12％
玉米同源四倍体籽粒胡萝卜素含量比二倍体原种增加43％
四倍体番茄Vc含量比二倍体高。
3、采用显微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法
雌核发育的意义与问题
意义: 1. 雌核发育为生产单性种群提供了可能。 2. 能得到同源型的二倍体克隆，在育种上具有重要性，也提供
了一种优越的研究品系。
3. 为遗传学研究提供材料。
问题:
1. 人工雌核后裔的成活率较低。 2. 精子在雌核发育过程中的真正作用未知。 3. 后代近亲繁殖衰退。
似鲤、爪似鹰、掌似虎、耳似牛”。
用同一种类的黑鼠和白鼠胚胎嵌合，可生下黑白相间的花小鼠； 不同种类的绵羊和山羊胚胎细胞嵌合，可生下绵山羊，它既有绵羊的特征，又 有山羊的特征。 对水貂、狐狸、绒鼠等毛皮动物，利用这项技术可以得到按传统的交配或杂交
法无法得到的皮毛花色后代，从而提高毛皮的价值，克服动物间杂交繁殖的障碍， 创造出新的物种。 利用其他动物代替大熊猫妊娠产仔，能够加快它的繁殖速度。 美国科学家将人类的干细胞加入到了许多动物的胚胎中，制造长着人的器官的 嵌合体动物，例如猪体内流着人的血液的“人猪”，羊体内的肝脏80%的成分属 于人类的肝脏的“人羊”，老鼠头颅里加入人的脑细胞的“人鼠”等。 “当人的器官在动物的体内生长，拥有人类细胞的猪或老鼠，是不是会像人类 一样思考，却和动物一样行事？” “它们所带给人类社会的恐惧，早已超越了人类认知的界限和人类对科学成果 的接纳空间”。
生。
+ 易位(reciprocal translocation):一个染色体上某一区段跟另一非同
源染色体上的区段发生互换。
20q12 4q25
易位
+ 缺失(deletion，del)：染色体的某一区段及其带有的基因一起丢
失。
4q27
4q13 4q25
末端缺失(terminal deletion)
举例：花药和花粉培养获得单倍体
花药和花粉培养：指离体培养花药和花粉，使小孢子改变原有
的配子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉
愈伤组织，最后形成花粉植株，从中鉴定出单倍体植株后经染 色体加倍后获得纯合的二倍体植物。 花药培养属于外植体培养，属于 离体器官培养的范畴； 花粉培养也成为小孢子培养，属
B-F：表皮细胞启动形成胚状
体的过程；G和H：分化出胚 根和子叶结构的胚状体
3、单倍体筛选
• 形态鉴定：简单直观，但形态标记数量少，鉴定的准确性低
• 结实性鉴定：产生果实的能力，周期慢
• 染色体数目鉴定：直观，准确，不够方便
• 生化标记鉴定：常用同工酶进行标记，受环境因素影响小， 检测相对简便，但标记数量少，受到一定限制。 • 分子标记鉴定：常用简单重复序列（SSR）、序列标记位点
雌性草鱼(鲤科) 2n=48
雄性三角鲂n=24
草鲂杂种3n=72
同源多倍体
三倍体无籽西瓜的培育过程图解
异源多倍体
人工培育的小黑麦
动物多倍体
皱纹盘鲍三倍体
牡蛎三倍体
珍母贝三倍体
动物多倍体现象比较少见： 一是动物的远源杂交能力很弱，难以形成 杂种个体。 养殖对虾三倍体 二是多倍体动物高度不育，染色体异常通 常会造成胚胎死亡。