酶标记和免疫层析法技术

❖ TMB经HRP作用后产物显蓝色，目视对比鲜 明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只 需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底 物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点， 因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL 或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色， 可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。
明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数 或延长浸泡时间。
❖ 显色 显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催
化无色的底物生成有色的产物。反应 的温度和时间仍是影响显色的因素。在定量测定中， 加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。
❖ 底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后 即不再加深，约40分钟将达到显色的顶峰，再延长 反应时间，可使本底值增高。底物液受光照会自行 变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入 终止液终止反应。产物用各类酸性终止液终止后会 使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm） 测读吸光值。
❖ 洗涤液 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲
液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的， 非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团， 其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合， 从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于 亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复 到水溶液状态，从而脱离固相载体。
❖ 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸， 其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板 式ELISA中一般采用2mol/L。
❖ 即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。 良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保 持了抗体（或抗原）的免疫活性。酶标记物中酶与 抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记 物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶 或游离的抗体（或抗原）。此外酶标记物还要有良 好的稳定性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物 酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶 (alkaline phosohatase, AP)。
❖ 1.3、ELISA方法的原理
❖ 基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，以聚苯乙烯塑料微 孔板为载体，在适当的技术条件下使抗原或抗体包被（吸附） 在酶标板微孔的内壁上成为包被抗体或抗原，没有被吸附的 抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接加入酶标记抗体或抗原 形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的 酶标记物洗涤去除，在微孔中加入底物溶液，复合物上的酶 催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。复合物上 酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用酶标仪进行 测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。这就是 ELISA的原理。
❖ 标本采集及处理过程的质控
❖ 取样：保证取样有代表性，即要遵循一定的取 样方法又要保证一定的取样比例（如：随机多 点取样、四分法等）
❖ 样品选取过程中需要避免产生交叉污染。如： 处理不同批次的样品时应更换使用的工器具或 对使用的工具进行彻底的清洗。
❖
❖ 加样 在ELISA实验中一般有5次加样步聚，即加临介血
清、加样本、加酶标记物、加底物、加反应终止液。 加样时应将所加物品加在LEISA板孔的底部，避免加 在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
加样时一般用微量加样器，按规定的量加入板孔 中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加 酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器， 使加液过程迅速完成。
ELISA原理及分类（图2-17）
❖ 上述三种方法又可以分为竞争法和非竞争法。下面对直 接法中的酶标抗原竞争法作重点说明。
❖ 在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测 定孔和对照孔，在对照孔中加入系列标准品溶液和酶标 记物；在测定孔中同时加入酶标记物和非酶标抗原（通 常来自于待测样品），酶标记物和样品互相竞争包被抗 体的结合点，经过温浴后，没有结合到包被抗体上的酶 标记物和样品经过洗涤去除。拍干后加入底物溶液，经 温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。 其反应原理如（图2-18）
❖ 参考标准品 定量测定的ELISA试剂盒应含有 制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可 检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保 护剂及防腐剂的缓冲液中。
❖
3、ELISA实验过程
❖ 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实 验中需用的试剂。ELISA实验中应用蒸馏水或 去离子水。自配的缓冲液的PH应用pH计进行 较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与 室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的 部分应及时放回冰箱保存。
比色
比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液 体，然后将板正确放入酶标比色仪的比 色架中。
比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence， A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波 长写于A字母的右下 角，如TMB的吸收波长为450nm，表示方法为 "A450nm"或"OD450nm"。
酶标记和免疫层析法技术
黄陂区人民医院
❖ 一、酶联免疫吸附测定法（ELISA）
❖ 1、1简介：基本概念：
❖ 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺
激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物 产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或 致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
❖ 抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由
免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性 结合的免疫球蛋白。
❖ 抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、 反应的等比例性
❖ 1.2、ELISA方法简介：
❖ ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由 荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单 易行并可以定量，从而使其在医学检验中得到 了广泛的应用。
❖
❖ 保温 在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一
次抗原抗体反应。抗原抗体反应的完成需要有一定 的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)。
❖ ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固 相表面上发生。加入板孔中的标本，其中的抗原并 不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近 孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一 个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的 终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合 也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一 定时间的温育。
❖ 酶标比色仪
酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测 读ELISA结果吸光度的光度计。酶标仪的检测 范围一般在0.000—3.000之间，甚至更高。超 出可测上限的A值常以"*"或"over"或其它符号 表示。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下， 操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器 15-30分钟，测读结果更稳定。
❖ 洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪 外，手工操作主要为浸泡式，过程如下：
a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍 （将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗 涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间 不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用
水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸 水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说
2、ELISA试剂的组成
❖ 完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂， 俗称酶标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）系列参考标准品（定量测定）； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液； （7）反应终止液。
❖
❖ 酶标记物：
❖ 仪器质控
为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准
操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）， 水浴箱（温箱），洗板机和酶标仪。
◎移液器：ELISA加样量小（5-100ｕl），其准确性直接影响 实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之 一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±2%以内； ◎水浴箱：经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温 箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差； ◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般 不超过2ul ，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞； ◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检 测校正，使其保持良好的工作性能。
❖ 洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，
但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤 来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原 或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异 性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等 塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时 又应把这种非特异性吸附的干扰物 质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是 最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视， 操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
❖ 是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗 原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定 酶反应产物的颜色可以反应一抗和抗原的结合情况，进而计 算出抗原或抗体的量。见图2-17（b）
❖ 夹心法：
❖ 是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用 酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可 以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合， 形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物，见图2-17（C）。前者 称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。
竞争法ELISA原理（图2-18）
酶标记物
底物溶液
E
E
E
E
E
E
E
E
EEEEE NhomakorabeaE
E
对 照 孔
參考液(不含抗原) 酶标记物
測 定 孔
樣本(含抗原)
E
E
E
E
E
底物溶液
E
E
竞争法ELISA原理简述
如图所示.在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测 定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液和酶 标记物；在测定孔中同时加入酶标记物和待检样本（抗原），酶 标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原— 抗体复合物固定在微孔内，复合物上的酶催化底物使其水解、氧 化还原成为有色的产物。
❖ 酶的底物
❖ 1、HRP的底物 HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的
过氧化物为H2O2，其反应式如下： DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。在
ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成 为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有 邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联 苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB) ❖ OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应 后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方 便，是HRP结合物最常用的底物。
❖ 1.4、ELISA方法的分类
❖ ELISA可以分为直接法、间接法和夹心法等几 种。
❖ 直接法：
❖ 直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标 板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原—抗体复 合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值， 计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图 2-17（a）
❖ 间接法：
当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标记物 结合加入底物后呈色较深，当样本含有抗原时，样本中的抗原和 酶标记物共同竞争抗体的结合位点，酶标抗原的比例越高，结合 在固相抗体上的酶标抗原就越多，酶标抗原的比例越低，结合在 固相上的抗体就越少，而在一定的条件下，复合物上酶的量和酶 产物呈现的色泽成正比，因此可以用酶标仪进行测定，从而计算 出参与反应的抗原和抗体的量。这就是竞争法ELISA的原理。
4、ELISA试验的质量控制
❖ 人员培训 ❖ 实验人员操作的技巧及熟练程度直接影响到检验结果，
因此检验人员需经过培训，熟练掌握相关的技术知识 和操作要点： ◎检验项目的基本原理 （ELISA原理）； ◎熟悉检测技巧，了解实验的关键环节及操作要点； ◎熟悉检测试剂性能（包括试剂盒组成，包被片段及 其组成）；