第三节 蛋白质一级结构
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• 肽链中的氨基酸由于形成肽键而成为不完整的分子，称为氨基 酸残基（amino acid residue）。 • 肽链骨干 重复单位是： —N —C —C —
（二）肽键（peptide bond）的结构
0.3Hale Waihona Puke Baidunm
Fig.1-9 The peptide bond is shown in its usual trans configuration.
第三节 蛋白质的共价结构 （一级结构）
The Covalent Structure of Protein
蛋白质的一级结构：
蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序和 连接方式。
一、肽和肽键的结构
（一）肽的结构：
结构通式：
氨基末端 （N末端）
羧基末端 （C末端）
小结：
• 蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键（peptide bond）。 • 有的蛋白质分子还具有二硫键disulfide bond），有链间二硫键 和链内二硫键两种形式。
DNFB + 蛋白质（多肽）
(aan)
DNP-蛋白质 强酸 （DNP-多肽）
DNP-aa + (n-1)个游离aa
有机溶剂 抽提 DNP-aa位于有机相
层析
• 丹磺酰氯（DNS）法
（分离和定性定量鉴定）
灵敏度高100倍，DNS-aa具强烈荧光，可直接用电泳和层析技术鉴定。
• 苯异硫氰酸酯法（PITC法, Edman法）
pK´=7.8
pK´=3.7
答： -NH2
pK´=4.6
-COOH
pK´=10.
2
-NH2
--COOH
pH6.0 +
-
+
-
所以，在pH6.0时，此四肽所带静电荷为“0”
（2）化学反应 • 茚三酮反应
多肽 + 茚三酮
蓝紫色物质
用于肽的定性、定量测量。
• 双缩脲反应
多肽（蛋白质）+ 碱性CuSO4试剂
二、肽的物理和化学性质
• 物理性质
— 短肽为晶体，熔点很高。 — 在水溶液中以兼性离子形式存在。 — 具旋光性，短肽的旋光度为各个氨基酸的旋光度之和。
• 化学性质
（1） 酸碱性质： 主要取决于游离末端的-NH2和-COOH及R基上可解离
基团。
例：试判断Gly-Glu-Lys-Ala 在pH6.0时的带电状态。
根据蛋白质摩尔数与末端残基（N端或C端）摩 尔数之比确定多肽链的数目。
比值=1，含1条肽链 ----＞单体蛋白质 比值≧2， 含2条以上肽链 ----＞寡聚蛋白质 （若末端残基多于一种，则蛋白质含有2条或多条 不同的肽链）
（二）N末端和C末端氨基酸残基的测定
1. N末端氨基酸残基的测定
• 二硝基氟苯法（DNFB法，Sanger法）
A链： 20aa B链： 31aa
A、B间通过2个二硫键连接，A内 还有链内二硫键。
Frederick Sanger
3对二硫键：
A7---B7 A20---B19 A6---A11
Fig.1-11 The amino acid sequence of the two chains of bovine insulin, which are joined by disulfide crosslinkages.
2. 核糖核酸酶(ribonuclease )
[美] Stanford Moore, 50s’末
Mr:12600
含一条多肽链 (124aa) 分子内含有4个二硫键: 26-84, 40-95, 58-110, 65-72
Fig.1-12 The disulfide crosslinks of the ribonuclease
一般原则：
• 测定蛋白质分子中多肽链的数目 • 拆分蛋白质分子的多肽链 • 断裂多肽链的二硫键 • 测定多肽链的氨基酸组成 • 分析多肽链的N末端和C末端残基 • 将多肽链断裂成肽段，并分离 • 测定各个肽段的氨基酸顺序 • 确定肽段在多肽链中的次序 • 确定原多肽链中二硫键的位置
（一）测定蛋白质分子中多肽链的数目
蛋白质（多肽）
PITC +
(aan)
PTC-蛋白质 弱酸 （PTC-多肽） 加热
aa n-1 + PTH-aa
3. 肌红蛋白(Mb) 血红蛋白(Hb)
Mb: 153aa Hb: 四聚体蛋白质
（22） ：141aa ：146aa
Identical in 3(Shaded） Conserved in 3(pink)
Fig.1-13 The amino acid sequence of Hemoglobin.
五、蛋白质分子氨基酸顺序的测定
• 在大多数情况下，肽键为反式构型（例外：Pro 有 顺反两种构型）。
位阻排斥
HH
Fig. 1-10 The trans and cis isomers of a peptide bond involving the amino nitrogen of proline. Over 99.95% of the peptide bonds between amino acid residues other than Pro are in the trans configuration.
2 GSH
-2H -Glu-Cys-Gly
+2H
S
S
-Glu-Cys-Gly
GSSG
2. 脑啡肽
甲硫氨酸型: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met 亮氨酸型： Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
四、蛋白质的一级结构举例
1. 胰岛素（insulin）
[英] Sanger 等，1953
Mr : 5700D 含两条肽链
（含两个肽键）
（双缩脲试剂）
此反应用于测定蛋白质的含量。
紫红色复合物
三、天然存在的活性肽
激素：胰岛素：含两条肽链（分别含30aa 和21aa） 催产素（8肽） 加压素（8肽）
抗生素：短杆菌肽S（环状10肽） 放线菌D（含2个环状5肽）
毒素：-鹅膏蕈碱（环状8肽）
1. 谷胱甘肽(GSH):
3肽：-Glu-Cys-Gly
Single bond 键长 0.145nm
Peptide bond 0.133nm
Double bond 0.125nm
小结：
• 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 • 肽键是一个平面——肽键平面（peptide plane）或 酰胺平面（amide plane），肽键中4个原子及两个相 邻的C位于一个平面上。
（二）肽键（peptide bond）的结构
0.3Hale Waihona Puke Baidunm
Fig.1-9 The peptide bond is shown in its usual trans configuration.
第三节 蛋白质的共价结构 （一级结构）
The Covalent Structure of Protein
蛋白质的一级结构：
蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序和 连接方式。
一、肽和肽键的结构
（一）肽的结构：
结构通式：
氨基末端 （N末端）
羧基末端 （C末端）
小结：
• 蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键（peptide bond）。 • 有的蛋白质分子还具有二硫键disulfide bond），有链间二硫键 和链内二硫键两种形式。
DNFB + 蛋白质（多肽）
(aan)
DNP-蛋白质 强酸 （DNP-多肽）
DNP-aa + (n-1)个游离aa
有机溶剂 抽提 DNP-aa位于有机相
层析
• 丹磺酰氯（DNS）法
（分离和定性定量鉴定）
灵敏度高100倍，DNS-aa具强烈荧光，可直接用电泳和层析技术鉴定。
• 苯异硫氰酸酯法（PITC法, Edman法）
pK´=7.8
pK´=3.7
答： -NH2
pK´=4.6
-COOH
pK´=10.
2
-NH2
--COOH
pH6.0 +
-
+
-
所以，在pH6.0时，此四肽所带静电荷为“0”
（2）化学反应 • 茚三酮反应
多肽 + 茚三酮
蓝紫色物质
用于肽的定性、定量测量。
• 双缩脲反应
多肽（蛋白质）+ 碱性CuSO4试剂
二、肽的物理和化学性质
• 物理性质
— 短肽为晶体，熔点很高。 — 在水溶液中以兼性离子形式存在。 — 具旋光性，短肽的旋光度为各个氨基酸的旋光度之和。
• 化学性质
（1） 酸碱性质： 主要取决于游离末端的-NH2和-COOH及R基上可解离
基团。
例：试判断Gly-Glu-Lys-Ala 在pH6.0时的带电状态。
根据蛋白质摩尔数与末端残基（N端或C端）摩 尔数之比确定多肽链的数目。
比值=1，含1条肽链 ----＞单体蛋白质 比值≧2， 含2条以上肽链 ----＞寡聚蛋白质 （若末端残基多于一种，则蛋白质含有2条或多条 不同的肽链）
（二）N末端和C末端氨基酸残基的测定
1. N末端氨基酸残基的测定
• 二硝基氟苯法（DNFB法，Sanger法）
A链： 20aa B链： 31aa
A、B间通过2个二硫键连接，A内 还有链内二硫键。
Frederick Sanger
3对二硫键：
A7---B7 A20---B19 A6---A11
Fig.1-11 The amino acid sequence of the two chains of bovine insulin, which are joined by disulfide crosslinkages.
2. 核糖核酸酶(ribonuclease )
[美] Stanford Moore, 50s’末
Mr:12600
含一条多肽链 (124aa) 分子内含有4个二硫键: 26-84, 40-95, 58-110, 65-72
Fig.1-12 The disulfide crosslinks of the ribonuclease
一般原则：
• 测定蛋白质分子中多肽链的数目 • 拆分蛋白质分子的多肽链 • 断裂多肽链的二硫键 • 测定多肽链的氨基酸组成 • 分析多肽链的N末端和C末端残基 • 将多肽链断裂成肽段，并分离 • 测定各个肽段的氨基酸顺序 • 确定肽段在多肽链中的次序 • 确定原多肽链中二硫键的位置
（一）测定蛋白质分子中多肽链的数目
蛋白质（多肽）
PITC +
(aan)
PTC-蛋白质 弱酸 （PTC-多肽） 加热
aa n-1 + PTH-aa
3. 肌红蛋白(Mb) 血红蛋白(Hb)
Mb: 153aa Hb: 四聚体蛋白质
（22） ：141aa ：146aa
Identical in 3(Shaded） Conserved in 3(pink)
Fig.1-13 The amino acid sequence of Hemoglobin.
五、蛋白质分子氨基酸顺序的测定
• 在大多数情况下，肽键为反式构型（例外：Pro 有 顺反两种构型）。
位阻排斥
HH
Fig. 1-10 The trans and cis isomers of a peptide bond involving the amino nitrogen of proline. Over 99.95% of the peptide bonds between amino acid residues other than Pro are in the trans configuration.
2 GSH
-2H -Glu-Cys-Gly
+2H
S
S
-Glu-Cys-Gly
GSSG
2. 脑啡肽
甲硫氨酸型: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met 亮氨酸型： Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
四、蛋白质的一级结构举例
1. 胰岛素（insulin）
[英] Sanger 等，1953
Mr : 5700D 含两条肽链
（含两个肽键）
（双缩脲试剂）
此反应用于测定蛋白质的含量。
紫红色复合物
三、天然存在的活性肽
激素：胰岛素：含两条肽链（分别含30aa 和21aa） 催产素（8肽） 加压素（8肽）
抗生素：短杆菌肽S（环状10肽） 放线菌D（含2个环状5肽）
毒素：-鹅膏蕈碱（环状8肽）
1. 谷胱甘肽(GSH):
3肽：-Glu-Cys-Gly
Single bond 键长 0.145nm
Peptide bond 0.133nm
Double bond 0.125nm
小结：
• 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 • 肽键是一个平面——肽键平面（peptide plane）或 酰胺平面（amide plane），肽键中4个原子及两个相 邻的C位于一个平面上。