分子生物学实验技术

二、cDNA的合成
5×Buffer
dNTPs RNA酶抑制剂
4μl
6μl 1μl
Oligo（dT） 随机引物
反转录酶AMV 提取的RNA
1μl 1μl
1μl 6μl
总体积
20μl
反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
种类：两种 1、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶 包括两个多肽亚基（最适温度42℃） 活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进 行内切降解(RNA酶H活性)。
2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物
绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，
此引物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被
反转录。
由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引
物合成的cDNA比随机六聚体引物得到的cDNA在
数量和复杂性方面均要小。
3、特异性引物
肤、手指、试剂、容器等。
采取的措施：
1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使 用一次性手套）。 2、所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小 时以上。 3、不能用高温烘烤的材料如塑料容器、试剂等可用 0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，然后高 压灭菌以消除残存的DEPC 。
注意事项：
用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特
异的PCR扩增。
第二章 聚合酶链式反应（PCR）
一、PCR基本步骤
三个步骤：
1、变性(Denature)：双链DNA目的片段在94℃下解
链。
2、退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃
左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。
Mg2+：
Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影 响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种
新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度 的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。
3、延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的
最适温度(72℃左右)下，以目的DNA为模板进行合成。
二、PCR反应中的主要成分
ddH2O
10×PCR Buffer dNTPs P1 P2 Taq cDNA template Total
32.7μl
5μl 4μl 2μl 2μl 0.3μl 4μl 50μl
1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。
2、DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT （二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水 配制，并尽可能用未曾开封的试剂。
总RNA提取方法（试剂盒）：
4、引物3‘-端最好与目的序列阅读框架中密码子 第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆 动产生的不配对。 5、在引物内，尤其在3‘-端应不存在二级结构， 且3’-端尽量不用T，尤应避免连续2个或2个以 上T，因为T引发错配的几率高。
6、两引物之间尤其在3‘-端不能互补，以防出现 引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个 连续碱基的同源性或互补性。 7、引物5'-端对扩增特异性影响不大，可在引物设 计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密 码子、缺失或插入突变位点等，通常应在5'-端限 制酶位点外再加1-2个保护碱基。
2、鼠白血病病毒(MLV)反转录酶
只有单个多肽亚基（最适温度37℃）
活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，
但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱，
且对热的稳定性较AMV反转录酶差。
MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。
Leabharlann Baidu
cDNA引物
种类： 1、随机六聚体引物：不特异的引物 体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模 板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。 通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带 负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影 响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。
模板：
PCR中模板DNA可以是单链分子，也可以是双链 分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状 分子比环状分子的扩增效果稍好)。
第一章 RNA的提取和cDNA的合成
RT-PCR原理及应用
提取总RNA 反转录 cDNA 作模板 PCR 获得目的基因
应用：基因检测、基因转录产物的分析、 合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统
一、RNA的提取

RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA酶的
污染，并设法抑制其活性。

RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人的皮
引物：好坏是PCR成败的关键。
设计原则： 1、引物长度约为16-30bp 2、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引 物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近 72℃最好。 3、四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G 或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错 误。
异硫氰酸胍－苯酚法（Trizol 法） 原理：首先用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞，同时 使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。释 放出来的DNA和RNA由于在特定pH时溶解度不 同，分别位于整个体系中的中间相和水相，从而 使DNA和RNA分离开来。进一步通过有机溶剂 来抽提沉淀RNA，就可以得到纯净的RNA。
8、引物不与模板结合位点以外的序列互补。
引物浓度：
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μ mol/L。
引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低
则降低产量。
4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：
dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分装，-20℃ 贮存。 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μ mol/L。 当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。 4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某 种dNTP的不足出现的错误掺入。