15 第十二章 新药临床前药物代谢动力学研究

第十二章新药临床前药物代谢动力学研究
第一节新药临床前药物代谢动力学研究的目的和意义
创新药物的开发是一项高风险、高投入和高回报的产业。

一旦一个创新药物开发成功并上市就可以为开发者带来巨额的利润。

但目前创新药物开发的成功率的很低,命中率约为五万分之一,在发达国家开发成功一种新药需要耗资5-10亿美元左右,研究周期约在10年左右。

许多体外研究认为很有前途的候选化合物可能因在体内活性很低甚至无体内活性或体内具有较大的毒性而夭折，造成极大的人力和财力的浪费。

缺乏体内活性可能是由于其药动学性质不理想，如首关消除较强或不易通过肠黏膜被吸收，生物利用度太低；或代谢太快，半衰期太短；或不易通过生物膜而进入靶器官。

而体内的毒性则可能是由于其在体内形成的毒性代谢物所致。

据文献报道进入临床试验后约有40%的候选化合物是由于药动学方面的原因而被淘汰的，这足以说明药动学研究在创新药开发研究中的作用。

一个候选化合物不仅要有较高的体外活性和较低的毒性，还应具有理想的药动学性质，即较高的生物利用度和理想的半衰期。

因此，在新药开发的早期阶段，可利用各种体内和体外模型对候选化合物药动学进行初筛，以便在研究开发的早期就确定该候选化合物是否有继续开发的价值，并可以根据筛选的结果对先导化合物进行结构改造或修饰，以获得具有良好药动学特性的新候选化合物。

最优的候选化合物是从一次次的优化循环中诞生的，每一次的优化循环都通过药理学、毒理学和药动学筛选结果反馈来指导下一步合成或结构改造。

这样循环往复最终产生具有良好的药理学、毒理学和药动学特性的最佳候选化合物，进入下一步的临床研究。

由此可见新药的临床前药动学研究在创新药物的开发研究中占有重要的地位，它与临床前药理学研究和毒理学研究一起构成一个三位一体的完整的新药筛选和评价体系。

临床前药动学研究的目的是阐明新药在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程和特点，并提供一些重要的药动学参数，进而揭示新药在体内动态变化规律性，包括吸收的速度和程度；全身分布情况，药物的血浆蛋白结合率；阐明代谢物的结构、转化途径及其动力学；排泄的途径、速率和排泄量。

它可以为
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设计和优化临床研究给药方案提供理论依据，确保临床用药的安全性和合理性。

同时还可为药效学和毒理学评价提供重要的线索，有助于我们了解药效或毒性的靶器官，阐明药效或毒性产生的物质基础，进而为新药的开发提供线索，对发展更为安全有效的新药及拟定解毒措施都有极其重要的指导意义。

第二节新药临床前药物代谢动力学研究的内容和方法
新药临床前药动学研究主要包括四个方面的内容，即药物的吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）及排泄（excretion），简称ADME，又称药物体内过程。

一．临床前药动学研究实验设计的基本原则
1.实验药品
实验所用的药品应与药效学和毒理学研究使用的药品相一致。

2.实验动物
一般采用健康成年动物。

常用动物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬和猴等。

实验动物选择的基本原则如下:
（1） 首选动物尽可能与药效学和毒理学研究所用的动物一致。

（2） 尽量在清醒状态下实验，动力学研究最好从同一动物多次采样。

（3） 创新药应选用两种或两种以上的动物，其中一种为啮齿类动物，另一种为非啮齿类动物，其主要目的是要了解药物的体内过程是否存在明
显的种属差异。

其他类型的药物，可选用一种动物（首选非啮齿类动
物，如犬等）。

（4） 实验中应注意雌雄动物兼用，以便了解药物的体内过程是否存在明显的性别差异，如发现存在明显的性别差异，应分别研究药物在雌雄动
物体内的动力学过程。

（5） 口服药药物不宜选用兔等食草类动物，因为这类动物的吸收不规则。

3.剂量选择
临床前药动学研究应设置至少三个剂量组，剂量的选择可以参考药效学和毒
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理学研究中所用的剂量，其高剂量最好接近最小中毒剂量，中剂量相当于有效剂量，这样所得结果更有利于解释药效学和毒理学研究中的现象。

设置三个剂量的主要目的是考察药物在体内的动力学过程是否属于线性，如为非线性动力学要研究剂量的影响。

4、给药方式和途径
所用的给药途径和方式，应尽可能与临床用药一致，对于大动物（如犬等）应使用与临床一致的剂型。

5．生物样品中药物分析方法的选择
目前常用的生物样品分析方法主要有以下几种：（1）色谱法：包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、色谱－质谱联用法（LC-MS、LC-MS/MS，GC-MS）等；（2）免疫学方法：包括放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等；（3）放射性核素标记法；（4）微生物学方法。

由于生物样品具有取样量少、药物浓度低、干扰物质多及个体差异大等特点，所以必须根据待测物的结构和理化性质、生物介质和预期的浓度范围，建立适宜的生物样品分析方法，并对方法进行确证。

所建立的方法必须具有足够的灵敏度、专一性、精确性和可靠性，并对方法进行确证，以确保生物样品测定结果的准确性和可靠性。

二．临床前药动学研究方法和内容
1．血药浓度-时间曲线
（1） 动物数的确定：一般以药-时曲线的每个时间点不少于5只动物数据为限计算所需动物数。

药时曲线最好从同一动物多次取样，尽量避免用多只动物合并样本，如采用多只动物合并样本应相应增加动物数，以减少个体差异对试验结果的影响。

考虑到药动学可能存在明显的性别差异，一般受试动物采用雌雄各半，如发现药动学确实存在明显的性别差异，应增加动物数以便了解药物在雌雄动物体内的药动学的差异情况。

对于单一性别用药的药物，可选择与临床用药一致的性别的动物进行药动学研究。

（2） 采样点的确定：采样点的确定对药动学参数的估算有直接的影响，若取样点过少或选择不当，所得的药-时曲线可能不能真实地反映药物在体内的动态变化规律性，由此计算的药动学参数也就失去了意义。

一个完整的药-时曲线，
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应包括药物的吸收分布相、平衡相和消除相，采样点的设计应兼顾到这三个时相
（如图12-1所示）。

一般在吸收分布相至少需要2～3个采样点，平衡相至少需
要3个采样点，消除相至少需要4～6个点。

整个采样时间至少应持续到3～5
个半衰期，或持续到血药峰浓度Cmax的1/10～1/20。

（3） 给药剂量和途径：药-时曲线研究至少应设置三个剂量组，以便考察
药物在体内的动力学过程是否属于线性过程，剂量的选择可以参考药效学和毒理
学研究中所用的剂量，其中一个剂量相当于有效剂量。

所用的给药途径和方式，
应尽可能与临床用药一致，如为口服给药，一般应在给药前应禁食12小时以上，
以排除食物对药物吸收的影响。

一般情况下只需要进行单剂量给药的药动学研
究，但对于半衰期长（给药间期短于4个半衰期）、有明显的蓄积倾向且临床需
长期给药的药物，应考虑进行多次给药的药动学研究。

（4） 药动学参数的估算：根据测得的血药浓度-时间数据，采用房室模型或
非房室模型的方法估算出其药动力学参数。

对于静脉注射给药的药物，应提供消
除半衰期t
、表观分布容积Vd、血药浓度-时间曲线下面积AUC、清除率CL等参1/2
数值；对于血管外给药的药物而言，除提供上述的参数外，还应提供峰浓度Cmax、
达峰时间Tmax、等参数值。

对于药动力学参数的估算目前一般主张采用非房室模
型的方法来估算，因为随着药动学研究的不断深入人们逐渐认识到房室模型的一
些不足之处，采用房室模型估算的有些药动力学参数常常与实测值存在较大的差
异。

图12-1 大鼠灌服高、中、低三个剂量盐酸雷诺嗪后的平均血药浓度-时间曲线
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2．药物的吸收
药物的吸收研究主要是针对血管外给药的药物而言的，它主要包含了两方面的研究内容即吸收的速度和程度。

对于失眠、疼痛等急性病的治疗，一般希望单剂量给药后药物能够迅速地到达体循环并发挥疗效，对于这类药物而言药物的吸收速度是至关重要的。

另一方面对于高血压、糖尿病和癫痫等慢性病的治疗，常常需要重复多次给药治疗，此时，药物的吸收程度就成了更重要的因素。

因此对于药物的吸收研究应根据具体的药物有所侧重。

（1）吸收速度 药物的吸收速度可以通过血药浓度-时间曲线来反映，吸收速度快的药物往往达达峰时间短，且峰浓度高；吸收速度慢的药物则正好与之相反。

因此药物在体内的Cmax和Tmax是反映药物吸收速度的两个最直观的指标和参数，常常被用于评价药物的吸收速度。

（2） 吸收的程度 药物的吸收程度则可以通过血药浓度-时间曲线下面积AUC来反映，AUC的面积越大表明药物的吸收越好，因此AUC是评价药物吸收程度的一个主要和重要的指标和参数。

对于血管外给药的药物，应尽可能提供其绝对生物利用度，即通过比较静注给药的AUC和血管外给药后的AUC来研究血管外给药的吸收速度和程度及绝对生物利用度，以便确定临床的最佳给药途径和剂型。

对于狗，猴等大动物所用剂型，应与第Ⅰ期临床试验相同。

（3）吸收机理对于口服的创新药物而言，除应进行整体动物实验，以便通过药-时曲线来了解药物在体内的吸收情况；还可采用体外吸收模型（如Caco-2细胞模型）以及在体或离体组织吸收模型（如离体肠管外翻模型、Ussing Chambers模型及在体或离体肠灌流模型）研究药物吸收特性和机理。

其中Caco-2细胞模型是近年来建立的一种新的体外吸收模型，具有同源性好（与肠上皮细胞结构相似）、所需药量少、与体内吸收的相关性好、可进行批量操作和成本低等特点，因此尤其适合于创新药物早期的吸收筛选研究。

可用于研究细胞对药物的摄取及跨膜转运；也可用于研究药物肠内代谢机制。

目前Caco-2细胞模型已经被广泛地用于体外吸收的研究，主要用于研究药物吸收机理及影响吸收的因素，进而了解药物的吸收特点及其影响因素。

如采用Caco-2细胞模型研究了氯苄律定、黄芪甲甙和盐酸关附甲素的体外吸收和体内吸收的相关性，结果见表12-1，结果表明药物的体内外吸收具有高
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度的相关性。

表12-1 药物在Caco-2细胞模型中的通透系数（Papp）与体内吸收的相关性
药物名称
药物浓度
（μg/ml）
P app
（cm·sec-1）
绝对生物利用度
(%)
氯苄律定 10 4.99×10-710.7
黄芪甲甙 50 6.65×10-8
2.3
盐酸关附甲素 1.0 4.14×10-3
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3．药物的分布
药物的组织分布试验主要是要了解药物在全身各组织的分布情况。

组织分布试验一般选用大鼠或小鼠，选择一个剂量（一般以有效剂量为宜）给药后，以药时曲线作参考，选3个时间点（每个时间点，至少应有5个动物的数据）分别于吸收分布相、平衡相和消除相取样，测定药物在心、肝、脾、肺、肾、胃、肠道、生殖腺、脑、体脂、骨骼肌等组织的浓度，以了解药物在体内的主要分布组织，特别应关注药物在靶器官（包括药效学与毒理学）的分布。

如大鼠灌胃25 mg/kg 盐酸雷诺嗪后，分别于10、30和360 min采集组织样本，采用LC/MS法测定药物在各组织中的浓度，其组织分布如图12-2所示，结果表明盐酸雷诺嗪在体内分布较广, 但未见有组织蓄积倾向。

其中以肝、肺、肾、胃、肠和脾浓度最高,提示这些组织可能是其毒性靶器官。

若某组织的药物浓度较高、持续时间长且临床上需要长期服用的药物，应研究其毒理学意义及体内的蓄积情况。

对于单剂量给药后有明显的蓄积倾向、半衰期长（给药间期短于4个半衰期）且临床需长期给药的药物，应考虑进行多次给药后的组织分布研究，以便进一步了解多次给药后药物在体内的蓄积情况。

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图12-2. 大鼠灌胃25 mg/kg盐酸雷诺嗪后组织中药物浓度
4．血浆蛋白结合试验
药物进入血浆或组织后，其中部分药物可与其中的蛋白质结合而形成结合型药物（bound drug），另一部分则以游离状态存在，称之为游离型药物（free drug）。

在血浆中药物主要与白蛋白结合，此外也可与血浆α-球蛋白和酸性糖蛋白结合。

药物与血浆蛋白的结合对药物的转运和药理活性会产生直接或间接影响，结合型的药物无法通过生物膜，因而不能进行转运并暂时失去药理活性，但由于药物与血浆蛋白的结合是疏松和可逆的，结合型药物与游离型药物之间常常处于动态平衡之中，因此药物与血浆蛋白的结合对药物的转运和药理活性的影响是暂时的，可以把它看成是药物的一种储存形式。

另外，药物与血浆蛋白的结合率可受到许多因素的影响而发生变化。

其一，由于血浆中蛋白质的含量及与药物结合的部位是有限的，因此药物与血浆蛋白的结合具有饱和性，当药物的浓度大于血浆蛋白的结合能力时，会导致血浆中游离型药物的急剧增加，进而引起毒性反应；其二，药物与血浆蛋白的结合有置换现象。

当两个高蛋白结合率的药物合用时就会出现置换抑制，其结果是一种药物被另一种药物所游离出来，使前者在血浆中的游离型药物的浓度急剧增加，如保泰松可以把结合型的双香豆素游离出来，而使血浆中游离型的双香豆素浓度成倍地增加，而导致出血倾向；其三，某些病理状态下，如慢性肾炎、肝硬化等可以导致血浆蛋白含量降低，使药物的血浆蛋白结合率降低，游离药物浓度增加。

有些药物在老年人中呈现出较强的药理效应部分与老年
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人的血浆蛋白减少有关。

因此药物的血浆蛋白结合率是药物重要的药动学参数之一。

药物在血浆中与蛋白结合的程度不一，常用血浆蛋白结合率来表示其结合的程度，血浆蛋白结合率可按下式计算：
蛋白结合率（%）=[(C t-C f)/ C t]×100%
其中C t为游离型和结合型药物的总浓度，C f为游离型药物的浓度。

目前常用的血浆蛋白结合试验的方法有平衡透析法、超过滤法、分配平衡法等，可以根据药物的特点选择其中的一种方法研究药物的血浆蛋白结合率，至少应进行三个浓度（应包括有效浓度在内）下的血浆蛋白结合率试验，以了解其血浆蛋白结合率，及其是否有剂量依赖性。

对于结合率大于90%的药物应考虑研究影响结合的各种因素，包括配伍用药物。

5．药物的排泄
排泄（excretion）是药物从体内消除的一种重要的方式之一。

药物进入体内后可以原形或其代谢产物的方式经排泄器官排出体外。

其主要的排泄途径为尿液、胆汁和粪便，肾脏是药物的主要排泄器官。

有些药物还可以通过呼吸道、唾液、乳汁、汗液排泄。

（1） 药物的尿和粪排泄：药物的尿和粪排泄研究一般采用小鼠或大鼠（每个时间段至少有5只动物的试验数据），将动物放入特制的代谢笼内，选择一个有效剂量给药后，按一定的时间间隔分段收集尿或粪的全部样品，包括药物从尿或粪中开始排泄、排泄高峰及排泄基本结束的全过程。

记录尿体积，混匀，取一部分样品，测定尿药浓度，计算药物经尿液排泄的速度及总排出量（占总给药量的百分比）；粪便样品可先制成匀浆，记录总体积，取部分样品进行药物含量测定；也可先称重，后研磨均匀，取一定量进行药物测定，计算药物经粪便排泄的速率及总排泄量（占总给药量的百分比）。

如盐酸雷诺嗪在大鼠尿液和粪便中排泄，大鼠按25 mg/kg灌胃给予盐酸雷诺嗪, 分别放入代谢笼中, 收集0～6、6～12、12～24、24～36和36～48小时尿液和粪便。

准确测量尿体积，取尿液 0.1 ml ，测定尿药浓度, 并根据尿药浓度和尿液体积折算成尿药量，计算尿累积排泄量和尿累积排泄百分率；粪便用水定量制成匀浆后,取 0.1 ml 匀浆液，测定粪便匀浆中药物的浓度，折算成粪药量、粪累积排泄量和粪累积排泄百分率。

盐酸雷诺嗪在大鼠尿液和粪便中的累积排泄
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曲线见图12-3和图12-4，结果显示尿液是盐酸雷诺嗪的主要排泄途径，仅有少量的药物通过粪便排泄。

图 12-3. 盐酸雷诺嗪(ig 25 mg/kg)在大鼠尿中的累积排泄曲线
图 12-4. 盐酸雷诺嗪(ig 25 mg/kg)在大鼠粪中的累积排泄曲线 （5） 胆汁排泄：一般用大鼠在乙醚麻醉下作胆管插管引流，待动物清醒后，以预先确定的途径给药，并以合适的时间间隔分段收集胆汁，记录胆汁体积，取一部分样品进行药物测定，计算药物经胆汁排泄的速率及总排泄量（占总给药量的百分比）。

如盐酸雷诺嗪在大鼠胆汁中排泄，大鼠用乙醚浅麻后作胆管插管手术,待动物清醒后, 按25 mg/kg灌胃给予盐酸雷诺嗪，分别于给药前及给药后0～2、2～4、4～6、6～8和8～12小时收集胆汁。

用LC/MS法分析胆汁中药物排
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泄量,计算胆汁中药物的累积排泄百分率（见图12-5），结果表明只有微量的药物是通过胆汁排泄的，这提示胆汁不是盐酸雷诺嗪的主要排泄途径。

图 12-5. 盐酸雷诺嗪(ig 25 mg/kg)在大鼠胆汁中的累积排泄曲线
若胆汁是药物的重要排泄途径，且口服吸收良好，则需要研究该药物是否存在肝肠循环。

对肝是重要结构转化部位或肝摄取较多的药物则应研究药物是否存在首关消除（first pass effect），为设计给药方案和选择适当的药物剂型提供参考依据。

6．药物的生物转化
药物的生物转化(biotransformation)，也称为药物的代谢(metabolism)，是药物从体内消除的另一种主要方式。

药物进入体内后部分药物在体内各种代谢酶的作用下进行生物转化，再以原型和代谢物的形式随粪便和尿液排出体外。

创新药物的体内代谢研究一般应选用两种或两种以上的动物，其中一种为啮齿类动物，一般选用大鼠；另一种为非啮齿类动物，一般选用犬，其主要目的是要了解药物在体内的主要的代谢方式、代谢途径、主要的代谢产物及其代谢是否存在明显的种属差异。

选择一定的剂量给药后分别采集血样、尿样和粪便，采用色谱方法分离和分析血样、尿样和粪便中可能存在的代谢产物，如发现有代谢物则可用色谱-质谱联用及色谱-核磁联用等技术进一步确定主要代谢物的结构。

若血药浓度与毒性、疗效缺乏相关性，则应探究是否存在活性药物代谢物，有必要对代谢物的活性和毒性开展进一步研究。

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此外，也可采用体外的方法研究药物的生物转化，目前常用的体外代谢模型有肝微粒体P450酶、肝切片模型、肝灌流模型和肝细胞培养模型等，这些方法尤其适合于创新药物的早期的药动学研究，可以进行大批量的药动学筛选，但采用该法所得的结果与体内代谢的一致性方面存在不足，因而其实验结果一般仅用于预测体内代谢情况，尚需体内代谢研究的进一步证实。

在上述的几种体外代谢模型中肝微粒体P450酶模型具有快速和简便的特点，因而应用最为广泛，如采用肝微粒体技术研究西尼地平在人肝微粒体内的代谢，结果发现西尼地平在人肝微粒体内被迅速代谢为三个代谢物，分别是西尼地平二氢吡啶环脱氢代谢物M1、二氢吡啶环侧链脱甲基代谢物M2、二氢吡啶环脱氢及其侧链脱甲基代谢物M3，其在人肝微粒体内的代谢途径如图12-6所示。

图12-6 西尼地平在人肝微粒体内的代谢途径
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7、对药物代谢酶活性的影响
参与药物代谢的细胞色素P450同工酶一个重要的特性就是可以被诱导或抑制。

许多临床常用的药物可以对P450酶产生诱导或抑制作用，前者可使药物的代谢加速而使药效减弱甚至失效；后者则可使药物的代谢减缓而使药效增强甚至产生严重的毒副作用。

因此有必要在临床前阶段观察药物对细胞色素P450同工酶的诱导或抑制作用，进而了解药物间的潜在的代谢相互作用。

可以运用肝微粒体技术在体外研究药物在肝微粒体内的代谢情况，如参与药物代谢的主要的
P450酶及其本身对P450酶的影响，药物的代谢是否存在明显的种属的差异，以便我们了解该药物是否存在潜在的代谢相互作用。

第三节生物样品分析技术的特点与要求
一．生物样品分析方法的特点
生物样品是指来自于生物机体的全血、血浆、血清、粪便、尿液或其他组织的样品，与一般的含量测定样品不同之处在于生物样品中的药物浓度低、干扰物质多（包括外源性物质如食物、同服的其他药物和药物本身的代谢物等及内源性物质如激素、维生素、胆酸、脂肪酸、氨基酸和生物胺等）、取样量少以及个体的差异大。

因此必须建立灵敏、专一、精确、可靠的生物样品定量分析方法，并对方法进行确证，这样才能确保生物样品测定结果的准确性和可靠性。

二．生物样品分析方法的基本概念
根据生物样品分析方法的特点，下面着重介绍一些与其方法学建立和确证有关的基本概念：
特异性(Specificity)：指样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物的能力。

标准曲线（Calibration Curve）：测定物质浓度与仪器响应值之间的关系，一般用回归分析方法（如用加权最小二乘法）获得的回归方程即标准曲线。

精密度(Precision )：精密度是指在确定的分析条件下，同一介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。

通常用质控样品的批内和批间相对标准差
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