05 生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质

聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质

【目的】

1 ．掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。

2 ．熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

【原理】

带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。

聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂过硫酸铵（ Ap ）和加速剂四甲基乙二胺（ TEMED ）的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。

聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章），使样品分离效果好，分辨率较高。一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是目前较好的支持介质，应用十分广泛。

图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱

根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚度为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中进行电泳分离。

【器材】

1 ．电泳仪

直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。

2 ．垂直管型圆盘电泳装置

目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。这类装置均由两个基本的部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀（ 5 ～ 6mm ） , 外径 7 ～ 8mm ，长 80 ～ 100mm 的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。另一部分为电泳液槽，可分为上下两槽。电泳时，上下两槽通过凝胶柱沟通电流（图 3-5 ）。

图 3-5 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A 为正面， B 为剖面 )

3 ．大号试管和中号试管

4 ．微量移液器

5 ． 5ml 注射器和 9 号注射针头

6 ．洗耳球、滤纸条、封口膜等

【试剂】

1 ．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺

一般性的分析工作，用分析纯的 Acr 和 Bis 即可，精细的分析工作，尤其是分子量的测定和定量分析，需商品 Acr 和 Bis 进行重结晶，进一步纯化。

2 ． N ， N ， N ＇， N ＇—四甲基乙二胺（ TEMED ）

商品 TEMED 即可，低温，避光保存。

3 ． 10% 过硫酸铵溶液（ AP ， W/V ）

10g 过硫酸铵定容到 10ml ，最好使用新鲜配制的溶液。

4 ．染色液

取三氯乙酸 200 g 加水 500ml ，然后加入 10 g 考马斯亮蓝 R 250 用玻璃棒搅拌，待完全溶解后，再加入蒸馏水加至 1000ml 。

5 ．脱色液的配制

取三氯乙酸 100 g 加蒸馏水溶解后加至 1000ml 。

6 ．储备液的配制

电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表：

储液配制好后放冰箱 4 ℃ 冷藏备用，用时 10 倍稀释，学生用时大约 3 天需更换一次。

7 ．凝胶液的配制

分离胶和浓缩胶的配制见下表：

8 ． 20% 蔗糖

100ml 取蔗糖 20g ，加少许蒸馏水溶解，最后加至 100 ml 。

9 ．加样缓冲液的配制 ( PH6.7 )

取 1mol 盐酸 4.8 ml ， Tris 0.6g ， 20% 蔗糖溶液 40ml ，加水至 80ml 充分混匀后，再加入 0.02g 溴酚蓝， 4 ℃ 保存备用。

【操作】

1 ．凝胶系统的聚合和制备

一般先制备分离胶，然后再在分离胶上面制作浓缩胶。

（ 1 ）电泳玻璃管的准备

取一根洁净的电泳玻璃管，垂直放在青霉素瓶盖的凹穴中或用封口膜密封，备用。

（ 2 ）分离胶（小孔胶）的制备

取分离胶 3ml 放入试管，加入100μl 10% Ap 溶液混匀后使用。

用微量移液器抽取胶液小心迅速加入到玻璃管内，当加到液面距离电泳玻璃管上口 2cm 时停止（约 1.6ml ）。注意在加的过程中不要混进空气，用过的注射器和针头要及时用水清洗，防止堵塞。

再在其上面小心覆盖 0.5cm 高的蒸馏水层（约 0.2ml ）以隔绝空气，并防止柱表面的弯月面。加水过程中不要用力过猛，防止将液面胶液冲起。刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志分离胶聚合已经开始，应使玻璃管垂直静置约 15~20 分钟后，完成凝胶的聚合过程。然后用滤纸小心吸去表面的水层，切勿破坏胶面的完整性。

（ 3 ）浓缩胶（大孔胶）的制备

取浓缩胶 1ml 放入试管，加入50μl 10%Ap 溶液混匀后使用。

用微量移液器吸取少量浓缩胶缓冲液漂洗一下分离胶的胶面，用滤纸吸取残留的缓冲液，滤纸尽量不要接触胶表面。

再加入约 1cm 高的浓缩胶（约 0.25ml ），表面也覆盖一层蒸馏水。刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志浓缩胶聚合已经开始，聚合 20~30 min 后除去上面的水层，同样不要破坏胶面的完整性。

吸去水层后用电泳缓冲液漂洗胶面，再用电泳缓冲液注满至管口，在室温下放置10~20 min 后即可使用了。

2 ．样品的制备和点样

（ 1 ）样品的准备：取兔血清 0.5ml ，加入 3ml 加样缓冲液混合。可在 4 ℃ 冰箱保存 2 周。

（ 2 ）点样：将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧，防止电泳中产生漏液。然后分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液，下槽的液面应没过玻璃管的下管口（注意不要有气泡存在）和电极丝；上槽的液面应没过玻璃管口 0.5~ 1cm 。用微量注射器吸取50μl 样品；标准蛋白样品 1 份（蛋白质含量

1mg/ml ，溶于加样缓冲液中）小心的加入玻璃管内，注意不要让样品溢出管口。

4 ．电泳

（ 1 ）电流电压条件

圆盘电泳：直流稳流电流强度通常为 4mA/ 管。

（ 2 ）电泳时间

一般约需 3 小时。样品中溴酚蓝电泳至距分离胶前缘约 1cm 处时即可停止电泳。