基因工程原理

上面都是识别6对碱基；还有识别8个碱基的如： NotI (GC↓GGCCGC). 由于切割位点不同，切割后产生的切口末端有： 平端：如EcoRV 粘端：如HindIII, KpnI等。粘端分为两种情况：5突出 和3突出。如HindIII 为3突出，KpnI为5突出。酶切后 产生的粘端退火后还可以互补。
3．II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点 （1）识别序列和切割位点 绝大多数的II类限制性内切酶识别顺序长度为4，5， 6碱基对，但也有比较长的，如8，或十几个等。这些碱 基对的顺序呈回文结构，不同酶的识别序列和切割位点 是不同的。基因工程操作中常用的酶为识别6对碱基的 内切酶，如
BamHI（G↓GATCC） EcoRI（G↓AATTC） SacI （GAGCT↓C） XbaI （T↓CTAGA） KpnI （GGTAC↓C）, Hind III（A↓AGCTT） EcoRV（GAT↓ATC） XhoI （C↓TCGAG） SalI （G↓TCGAC）, ApaI （GGGCC↓C）
第四章 基因工程的一般原理
一、基因克隆所用的酶 酶是生物细胞产生的在体内外对生物化学物质起 催化作用的一类蛋白质。酶催化具有高效性、专一性 及其可调性。酶发挥作用需要最适的条件：温度、PH、 离子及其强度等。（酶的活性单位指在最适条件下在 1min 催化1 umol底物发生反应的酶量）。 生物体几 乎所有的反应是在酶的催化下进行的。 基因克隆所用的酶主要有：限制性核酸内切酶、 甲基化酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、反转录酶、磷 酸酶、RNA酶等。
（1）质粒的基本 pMB1 or ColE1 origin），因此它能独立宿主细胞的染色体DNA， 而自主复制。一种质粒载细胞的数目称为质粒的拷贝数。 不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，（复制需要的 多种酶由宿主细胞提供）根据质粒在宿主细胞所含拷贝数 得多少，将质粒分为两类：高拷贝的叫松弛型，一般在 10-60；低拷贝的叫严紧型，一般在1-3个。
2. II类限制性内切酶的命名 命名方法：取细菌属名的第一个字母（大写）、种 名的前两个字母（小写） 株名第一个字母（大写或小 写）和发现顺序（罗马字母）进行命名。如，在大肠杆 菌（Escherichia coli）R株发现的第一、第五个内切 酶分别叫EcoRI、EcoRV；从流感嗜血杆菌 （Haemophilus Influenzue） d株发现的第二和第三 个酶分别叫HindII, HindIII.
理想的载体具备的条件： 具有自主复制能力（即具有与特定受体细胞相适应的复制 位点或整合位点）； 具有多种单一的限制性酶切位点； 具有合适的选择性遗传标记（抗性标记）； 具有对受体细胞的亲和性（可转移性）； 具有较小的分子量，以提高其载装能力。
克隆载体的种类：在基因工程中常用的载体有：质粒 载体（主要指人工构建的质粒）、粘粒载体、酵母人工染 色体、λ噬菌体载体、M13 噬菌体载体、病毒载体。 1. 质粒载体（Plasmid vector） 质粒是指菌体内独立于染色体外的能够自我复制的双 链环状DNA。（Plasmid: Autonomously (self) replicating, extrachromosomal circular DNA molecules, distinct from the normal bacterial genome and usually not essential for cell survival. Some plasmids are capable of integrating into the host genome. A number of artificially constructed plasmids are used as cloning vectors）分子量不等：
下面为ColE1复制起始点序列 （引于pcDNA3.1质粒载体） CATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAA AGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCT GACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCG AAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGG AAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTAC CGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCT TTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTC GTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCA GCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTC CAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCAC TGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTAC AGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAG AACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTC GGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACC GCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACG CGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGAT(674bp)
E.coli plasmid DNA of RNAI and RNAII promoter region. 红色为与pcDNA3.1 相 似的序列。 1 aagagtgatg gagatgagga cataaagtga ccactctgta cgtttatcgt gagaggggat 61 atgtaaaaag atctcaagat cctcttgaga tccttttttt tgcgcgcaat ctgctgtctg RNAII RNAII 121 tagacgaaaa aaccaccctg gcaggtggtt tttcgaaggt taaataatcc tggcagatta 181 tttaaccgtg gtaacagggt gtacaagacc gctgccacca aatctgtcct ttcagtgtag RNAI 241 ccgcagttgg tccttcactt caagaactac gtatcagcaa tttcttgtac atcctctacc RNAI 301 agtggctgct gccagtggcg ttaaggcgtg a
2. 甲基化酶在基因工程中用途 就许多II类限制性内切酶而言，都相应存在着相对的 甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤 上，从而使免受的切割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲 硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位 腺嘌呤上（GAATTC），从而使DNA免受EcoRI的切割 因此甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性内 切酶的切点。
（三 ） T4 DNA连接酶（T4 DNA Ligase） 来源于T4噬菌体，感染的大肠杆菌，连接修复3‘端羟 基和5’端磷酸基因，脱水形成3‘-5’磷酸二酯键。 1. 连接双链DNA上的单链缺口（Nick），因此亦可连 接限制内切酶所产生的粘性末端 2. 连接RNA模板上的DNA链缺口 3. 连接平头双链DNA， 速度很慢，在高浓度的底物和 酶的作用下方可进行，这属于分子之间的连接.
（Rop因子基因序列：gtgattacca agcaacaaaa aatgacactg aacatggcga aattcattca ggcgcaatct 61 ctacttttgc tggagaagct caacgaactg gatctcgata ctgaggccaa catgtgcgaa 121 aaactgcatg aggatgcgga acagctattc cgcactctgg ctcttcgtct ggatgatctt 181 caaggagatt tataa gtgattaccaagcaacaaaaaatgacactgaacatggcgaaattcattcaggcgcaatct V I T K Q Q K M T L N M A K F I Q A Q S ctacttttgctggagaagctcaacgaactggatctcgatactgaggccaacatgtgcgaa L L L L E K L N E L D L D T E A N M C E aaactgcatgaggatgcggaacagctattccgcactctggctcttcgtctggatgatctt K L H E D A E Q L F R T L A L R L D D L caaggagatttataa Q G D L - ）
5’GAATTC3’ 3’CTTAAG5’ EcoRI 5’G 3’CTTAA5’
+
AATTC3’ G5’
1. 限制性核酸内切酶的类型 分为三大类型：I、II、III。 I类: 识别位点不专一，依赖ATP II类: 识别位点专一，切点专一。 III类: 识别位点专一，但切点不专一 ，依赖ATP.
因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切 酶。1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类 内切酶，HindII和HindIII，为基因工程技术的诞生奠定基 础 目前已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300 种商品化的约有一百种，而实验室常用的有三十多种。
（四）Klenow 酶（大肠杆菌DNA聚合酶I 的大片段） 该酶无5‘-3’外切活性，保留了5‘-3’聚合活性及3‘-5’ 外切活性基因工程中利用该酶填平5‘突出的粘性末端。
（五）碱性磷酸单酯酶
二、 基因工程的克隆载体
基因克隆载体是指携带外源基因进入受体细胞并使 其大量复制的一类DNA分子。(Cloning vectors are used to introduce foreign DNA into host cells, where that DNA can be reproduced (cloned) in large quantities.) 载体可以是天然的，也可以是人工 构建的。
（2）同裂酶（isoschizomers）：来源不同但识别序列 和切割位点相同的内切酶叫同裂酶。如：XhoI and PaeR71. （3）不完全同裂酶：识别序列相同但切点不同叫不完全 同裂酶。 如：SmaI（CCC↓GGG） 和 XmaI （C↓CCGGG） （4）同尾酶（isocaudamers,互补粘末端的酶）：识别 序列不同但酶切后产生的粘性末端相同叫同尾酶。如 XbaI（ T↓CTAGA ）and SpeI（A↓CTAGT） 等。
B. 不相容性
两种亲缘关系密切的质粒，不能在同一宿主细胞稳定 地存在，这一现象叫质粒的不相容性或不亲和性。
如带有pMB1 or ColE1复制子的质粒彼此不相容，但它们与带有pSC101 and p15A复制子的质粒相容。 （如利用同一复制系统（RNAII、RNAI、Rop因子）的不同质粒）（注： RNAII（RNA 引物）；RNAI（由RNAII 同一区段DNA的互补链转录而来，可与RNAII结合，从而抑制RNAII引物的作用，63氨基酸的Rop因子可以促进前 二者的结合）
（一）限制性核酸酶内切酶（Endonucleosase）
上世纪50年代初，有人发现了细菌能将外来的 DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为 外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被 一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做寄 主的限制－修饰。根据限制-修饰现象，发现了限制 性核酸内切酶，现已经成为重组DNA技术的主要工 具酶。限制性核酸内切酶可以水解DNA内部特异位 点的磷酸二酯键，产生3-OH和5-磷酸基。
（二） 甲基化酶 在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应 1. 大肠杆菌中的甲基化酶 （1）dam甲基化酶： 此酶可在5'GATC3'序列中的腺 嘌呤N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有 5'GATC3'的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA。 如BclI（TGATCA），但BamHI（GGATCC）则不会因 为N6的甲基化而失去活性，因为这两种酶对底物的特异 性不同。 （2）dcm甲基化酶： 此酶在序列5'CCAGG3'或 5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制 性内切酶是EcoRII