Wnt信号通路在骨关节炎发病机制中作用的实验研究
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传统骨关节炎治疗方法：用针扎穴位的方式进行治疗，通过医生对患者部位进行手术方式进行治疗，对患者生活进行细心的照料进而对其进行治疗和在患者穴位中注入某种物质使其功能得到恢复。一开始人们主观上认为 OA 的发病与某些蛋白酶类产生有关联[4]。这类蛋白有白介素、肿瘤坏死因子等细胞因子和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)等蛋白酶。然而通过临床上研究如果使用抗炎药物或蛋白酶抑制剂对 OA 患者进行治疗的结果显示。这些药并没有取得很好的治疗效果。OA发病机制任然需要更深层次的研究。因此从分子角度深入研究骨关节炎的发病机制以及它的产生和发展过程。近年来的研究显示，软骨破坏在 OA 发病中占有比较重的因素，然而导致软骨破坏的主要环节是软骨细胞参与了介导。随着细胞的增多，基质蛋白和生长因子、细胞因子以及其他炎性介质的产生等。近年来越来越多的研究显示，信号通路在 OA 的发病机制中扮演着重要的角色。
2.1.2 实验试剂
质量分数为20%FBS的DMEM-F12（购自美国Hyclone公司）；体积分数为5% 的CO2；ELISA 试剂盒（购自江苏绿叶生物科技有限公司）； 10% 中性福尔马林溶液（购自南京化学试剂股份有限公司）；60%双蒸水（购自武汉卡诺斯科技有限公司）；HE 染料（购自青岛科创质量检测有限公司）；番红 O 染料（购自天津百伦斯生物技术有限公司）；Western blot检测器（购自南京晓晓仪器设备有限公司）；石膏；及兔子Wnt/β-catenin信号通路相关因子，例如：β-catenin和MMPs（购自杭州华安生物技术有限公司）
1 绪 论
骨关节炎（osteoarthritis,OA）是很普遍的骨关节疾病，是力学和生物学因素一起作用下引起。关键是由关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨三者形成和降解的失衡而引发的滑膜炎。临床表现为关节软骨变性和软骨下骨硬化，因此 OA 患者行动会受到阻碍，尤其在上、下楼梯中的困难，极大程度上极大上影响了人们生活质量。OA 被认为健康的三大杀手之一[1]。因此，把每年的 10 月 12 日定为“国际关节炎日”。
2 实验方法
2.1 研究对象与试剂
2.1.1 研究对象
实验动物 8月龄左右健康普通级雄性的新西兰大耳兔40只，体重 2~2.5 kg，用复合饲料喂养(饲料由安徽医科大学实验动物中心提供)，饲养温度 20-25℃，湿度 65%。实验动物是由安徽医科大学动物实验中心提供。将其分为实验组和对照组。
实验动物也可以选择 SPF 级健康清洁级 2 月龄雌性 SD大鼠 68 只，体质量450-455g，实验动物是由安徽医科大学动物实验中心提供，并提供大鼠适宜的生存环境，将其分为实验组和对照组。动物模型的选择上应该遵循的 3 个原则：相关性、适当性和实用性。相关性指所选动物能够比较好地呈现出人类在生这类病时的病理现象及特征；适当性的要求是应用的动物便于调查研究，其次是该动物更加适合实验目的和要求；实用性是指该动物来源充分、易于控制、饲养动物的成本和条件要求不高等，再综合实验的需要本次实验选择兔子。
近而 Wnt/β-catenin信号通路在骨骼发育和骨骼系统相关疾病的发病机理中成为研究的新热点，同时该研究对 OA 的治疗也有着很重要的意义。本实验也将对 Wnt/β-catenin 信号通路进行实验设计，探讨该通路作用。实验过程中对动物处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》[8]，并且在动物模型的选择上应该遵循的3 个原则。
传统骨关节炎治疗方法中针灸治疗效果最为显著。周景辉等[6]发现，针灸治疗是通过降低 MMP-3、转化生长因子β、白细胞介素1β 和肿瘤坏死因子 α 的水平，延缓膝关节软骨的破坏，改善膝关节功能，从而发挥其治疗的作用，并且治疗的有效率高达已经 90% 以上。随着科技的发展骨关节炎治疗方法有了进一步的进展。在骨关节炎治疗的研究中，我们要选择合适的方法去治疗疾病，这对治疗效果有着很大影响。有关骨关节炎的治疗，主要从骨关节炎发病的病因对其进行治疗同时也要考虑患者的身体因素、环境因素和心理因素等结合对患者进行综合治疗。
现代的骨关节炎主要的治疗方式是在从之前的传统方式上增加一些现代已经研究出来，可以达到治疗效果的药物。简称：药物与非药物联合。随着科技的发展和对该疾病治疗方式深层Байду номын сангаас的研究有了一些重大的突破。信号通路在骨关节炎治疗中扮演着重要角色，包括：转录生长因子-β (TGF-β)的信号通路、TLRs 和 NF-κB 蛋白、蛋白激酶(AMP—activated protein kinase，AMPK) 和 Wnt-β-catenin 信号通路等。在错中复杂的通路中 Wnt/β-catenin 信号通路在 OA 的发病机制中起着至关重要的作用[7]。大量研究表明 Wnt/β-catenin 信号通路与骨关节炎的病理变化有着密切的联系。该通路也是被研究最多的。
随着目前社会老龄化逐渐严重它更将成为中、老年人骨骼疼痛和活动障碍的最主要原因之一[2]。调查结果显示大陆地区 40岁以上人群原发性 OA 患病率 46% 多而其中男性为 41% 左右，女性为 50%，由此可以看出女性发病率较高。从数据的总体上我们可以发现随着年龄的增长患 OA 比率在逐渐升高，然而本病的致残率将高达到 53% 多[3]。因此对 OA 的治疗已经是迫在眉睫, 但对其最关键的发病机制并不清楚。
2.2造模
为了研究骨关节炎发病的最根本原因和治疗的方法，因此需要我们去构建可靠的小动物模型。模型的制作可以分为2类：人工诱发模型和自发模型。自发模型是实验动物在自然情况下并没有任何的人为处理导致的炎症。人工诱发模型也就是诱导模型，诱导模型分为：手术方法和非手术方法，手术法包括：关节内手术和关节外手术，关节内手术有：半月板全/部分/根部切除；Hulth法；改良Hulth法；前交叉韧带切除；内侧副韧带切除，还有一种是在关节外进行手术操作：软骨损伤；关节周围肌肉破坏；关节血液循环破坏；关节撞击。而非手术法包括：关节制动和腔内药物注射，关节制动是用石膏固定于伸直位、屈曲位；腔内药物注射的药物有：木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶、尿素酶等。使用最多的腔内注射药物是木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，注入腔内后能够分解细胞基质的蛋白多糖。这个多糖对细胞起到比较好的保护作用。如果这类多糖被破坏将会导致软骨细胞破坏以至于使得软骨降解，因此成为软骨的弹性、退变和硬度重要指标[10]。不同的造模方法有其各自的特点，例如：关节内手术诱导的骨关节炎模型快速、稳定、可重复但会导致早期的炎性递质的释放。关节外手术诱导不会导致关节内结构的破坏和关节内出血，但造模的时间比较长。非手术诱导，如关节制动的有点比较其他造模方法有点较多，不足之处仅仅在于外用固定器的脱落。结合不同的造模方式优点和不足以及本实验自身要求，将选择关节制动法进行造模。
2.1.2 实验试剂
质量分数为20%FBS的DMEM-F12（购自美国Hyclone公司）；体积分数为5% 的CO2；ELISA 试剂盒（购自江苏绿叶生物科技有限公司）； 10% 中性福尔马林溶液（购自南京化学试剂股份有限公司）；60%双蒸水（购自武汉卡诺斯科技有限公司）；HE 染料（购自青岛科创质量检测有限公司）；番红 O 染料（购自天津百伦斯生物技术有限公司）；Western blot检测器（购自南京晓晓仪器设备有限公司）；石膏；及兔子Wnt/β-catenin信号通路相关因子，例如：β-catenin和MMPs（购自杭州华安生物技术有限公司）
1 绪 论
骨关节炎（osteoarthritis,OA）是很普遍的骨关节疾病，是力学和生物学因素一起作用下引起。关键是由关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨三者形成和降解的失衡而引发的滑膜炎。临床表现为关节软骨变性和软骨下骨硬化，因此 OA 患者行动会受到阻碍，尤其在上、下楼梯中的困难，极大程度上极大上影响了人们生活质量。OA 被认为健康的三大杀手之一[1]。因此，把每年的 10 月 12 日定为“国际关节炎日”。
2 实验方法
2.1 研究对象与试剂
2.1.1 研究对象
实验动物 8月龄左右健康普通级雄性的新西兰大耳兔40只，体重 2~2.5 kg，用复合饲料喂养(饲料由安徽医科大学实验动物中心提供)，饲养温度 20-25℃，湿度 65%。实验动物是由安徽医科大学动物实验中心提供。将其分为实验组和对照组。
实验动物也可以选择 SPF 级健康清洁级 2 月龄雌性 SD大鼠 68 只，体质量450-455g，实验动物是由安徽医科大学动物实验中心提供，并提供大鼠适宜的生存环境，将其分为实验组和对照组。动物模型的选择上应该遵循的 3 个原则：相关性、适当性和实用性。相关性指所选动物能够比较好地呈现出人类在生这类病时的病理现象及特征；适当性的要求是应用的动物便于调查研究，其次是该动物更加适合实验目的和要求；实用性是指该动物来源充分、易于控制、饲养动物的成本和条件要求不高等，再综合实验的需要本次实验选择兔子。
近而 Wnt/β-catenin信号通路在骨骼发育和骨骼系统相关疾病的发病机理中成为研究的新热点，同时该研究对 OA 的治疗也有着很重要的意义。本实验也将对 Wnt/β-catenin 信号通路进行实验设计，探讨该通路作用。实验过程中对动物处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》[8]，并且在动物模型的选择上应该遵循的3 个原则。
传统骨关节炎治疗方法中针灸治疗效果最为显著。周景辉等[6]发现，针灸治疗是通过降低 MMP-3、转化生长因子β、白细胞介素1β 和肿瘤坏死因子 α 的水平，延缓膝关节软骨的破坏，改善膝关节功能，从而发挥其治疗的作用，并且治疗的有效率高达已经 90% 以上。随着科技的发展骨关节炎治疗方法有了进一步的进展。在骨关节炎治疗的研究中，我们要选择合适的方法去治疗疾病，这对治疗效果有着很大影响。有关骨关节炎的治疗，主要从骨关节炎发病的病因对其进行治疗同时也要考虑患者的身体因素、环境因素和心理因素等结合对患者进行综合治疗。
现代的骨关节炎主要的治疗方式是在从之前的传统方式上增加一些现代已经研究出来，可以达到治疗效果的药物。简称：药物与非药物联合。随着科技的发展和对该疾病治疗方式深层Байду номын сангаас的研究有了一些重大的突破。信号通路在骨关节炎治疗中扮演着重要角色，包括：转录生长因子-β (TGF-β)的信号通路、TLRs 和 NF-κB 蛋白、蛋白激酶(AMP—activated protein kinase，AMPK) 和 Wnt-β-catenin 信号通路等。在错中复杂的通路中 Wnt/β-catenin 信号通路在 OA 的发病机制中起着至关重要的作用[7]。大量研究表明 Wnt/β-catenin 信号通路与骨关节炎的病理变化有着密切的联系。该通路也是被研究最多的。
随着目前社会老龄化逐渐严重它更将成为中、老年人骨骼疼痛和活动障碍的最主要原因之一[2]。调查结果显示大陆地区 40岁以上人群原发性 OA 患病率 46% 多而其中男性为 41% 左右，女性为 50%，由此可以看出女性发病率较高。从数据的总体上我们可以发现随着年龄的增长患 OA 比率在逐渐升高，然而本病的致残率将高达到 53% 多[3]。因此对 OA 的治疗已经是迫在眉睫, 但对其最关键的发病机制并不清楚。
2.2造模
为了研究骨关节炎发病的最根本原因和治疗的方法，因此需要我们去构建可靠的小动物模型。模型的制作可以分为2类：人工诱发模型和自发模型。自发模型是实验动物在自然情况下并没有任何的人为处理导致的炎症。人工诱发模型也就是诱导模型，诱导模型分为：手术方法和非手术方法，手术法包括：关节内手术和关节外手术，关节内手术有：半月板全/部分/根部切除；Hulth法；改良Hulth法；前交叉韧带切除；内侧副韧带切除，还有一种是在关节外进行手术操作：软骨损伤；关节周围肌肉破坏；关节血液循环破坏；关节撞击。而非手术法包括：关节制动和腔内药物注射，关节制动是用石膏固定于伸直位、屈曲位；腔内药物注射的药物有：木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶、尿素酶等。使用最多的腔内注射药物是木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，注入腔内后能够分解细胞基质的蛋白多糖。这个多糖对细胞起到比较好的保护作用。如果这类多糖被破坏将会导致软骨细胞破坏以至于使得软骨降解，因此成为软骨的弹性、退变和硬度重要指标[10]。不同的造模方法有其各自的特点，例如：关节内手术诱导的骨关节炎模型快速、稳定、可重复但会导致早期的炎性递质的释放。关节外手术诱导不会导致关节内结构的破坏和关节内出血，但造模的时间比较长。非手术诱导，如关节制动的有点比较其他造模方法有点较多，不足之处仅仅在于外用固定器的脱落。结合不同的造模方式优点和不足以及本实验自身要求，将选择关节制动法进行造模。