Wnt信号通路在骨关节炎发病机制中作用的实验研究

1 绪 论
骨关节炎（osteoarthritis,OA）是很普遍的骨关节疾病，是力学和生物学因素一起作用下引起。关键是由关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨三者形成和降解的失衡而引发的滑膜炎。临床表现为关节软骨变性和软骨下骨硬化，因此 OA 患者行动会受到阻碍，尤其在上、下楼梯中的困难，极大程度上极大上影响了人们生活质量。OA 被认为健康的三大杀手之一[1]。因此，把每年的 10 月 12 日定为“国际关节炎日”。
随着目前社会老龄化逐渐严重它更将成为中、老年人骨骼疼痛和活动障碍的最主要原因之一[2]。调查结果显示大陆地区 40岁以上人群原发性 OA 患病率 46% 多而其中男性为 41% 左右，女性为 50%，由此可以看出女性发病率较高。从数据的总体上我们可以发现随着年龄的增长患 OA 比率在逐渐升高，然而本病的致残率将高达到 53% 多[3]。因此对 OA 的治疗已经是迫在眉睫, 但对其最关键的发病机制并不清楚。
传统骨关节炎治疗方法：用针扎穴位的方式进行治疗，通过医生对患者部位进行手术方式进行治疗，对患者生活进行细心的照料进而对其进行治疗和在患者穴位中注入某种物质使其功能得到恢复。一开始人们主观上认为 OA 的发病与某些蛋白酶类产生有关联[4]。这类蛋白有白介素、肿瘤坏死因子等细胞因子和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)等蛋白酶。然而通过临床上研究如果使用抗炎药物或蛋白酶抑制剂对 OA 患者进行治疗的结果显示。这些药并没有取得很好的治疗效果。OA发病机制任然需要更深层次的研究。因此从分子角度深入研究骨关节炎的发病机制以及它的产生和发展过程。近年来的研究显示，软骨破坏在 OA 发病中占有比较重的因素，然而导致软骨破坏的主要环节是软骨细胞参与了介导。随着细胞的增多，基质蛋白和生长因子、细胞因子以及其他炎性介质的产生等。近年来越来越多的研究显示，信号通路在 OA 的发病机制中扮演着重要的角色。
传统骨关节炎治疗方法中针灸治疗效果最为显著。周景辉等[6]发现，针灸治疗是通过降低 MMP-3、转化生长因子β、白细胞介素1β 和肿瘤坏死因子 α 的水平，延缓膝关节软骨的破坏，改善膝关节功能，从而发挥其治疗的作用，并且治疗的有效率高达已经 90% 以上。随着科技的发展骨关节炎治疗方法有了进一步的进展。在骨关节炎治疗的研究中，我们要选择合适的方法去治疗疾病，这对治疗效果有着很大影响。有关骨关节炎的治疗，主要从骨关节炎发病的病因对其进行治疗同时也要考虑患者的身体因素、环境因素和心理因素等结合对患者进行综合治疗。
现代的骨关节炎主要的治疗方

式是在从之前的传统方式上增加一些现代已经研究出来，可以达到治疗效果的药物。简称：药物与非药物联合。随着科技的发展和对该疾病治疗方式深层次的研究有了一些重大的突破。信号通路在骨关节炎治疗中扮演着重要角色，包括：转录生长因子-β (TGF-β)的信号通路、TLRs 和 NF-κB 蛋白、蛋白激酶(AMP—activated protein kinase，AMPK) 和 Wnt-β-catenin 信号通路等。在错中复杂的通路中 Wnt/β-catenin 信号通路在 OA 的发病机制中起着至关重要的作用[7]。大量研究表明 Wnt/β-catenin 信号通路与骨关节炎的病理变化有着密切的联系。该通路也是被研究最多的。
近而 Wnt/β-catenin信号通路在骨骼发育和骨骼系统相关疾病的发病机理中成为研究的新热点，同时该研究对 OA 的治疗也有着很重要的意义。本实验也将对 Wnt/β-catenin 信号通路进行实验设计，探讨该通路作用。实验过程中对动物处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》[8]，并且在动物模型的选择上应该遵循的3 个原则。
2 实验方法
2.1 研究对象与试剂
2.1.1 研究对象
实验动物 8月龄左右健康普通级雄性的新西兰大耳兔40只，体重 2~2.5 kg，用复合饲料喂养(饲料由安徽医科大学实验动物中心提供)，饲养温度 20-25℃，湿度 65%。实验动物是由安徽医科大学动物实验中心提供。将其分为实验组和对照组。
实验动物也可以选择 SPF 级健康清洁级 2 月龄雌性 SD大鼠 68 只，体质量450-455g，实验动物是由安徽医科大学动物实验中心提供，并提供大鼠适宜的生存环境，将其分为实验组和对照组。动物模型的选择上应该遵循的 3 个原则：相关性、适当性和实用性。相关性指所选动物能够比较好地呈现出人类在生这类病时的病理现象及特征；适当性的要求是应用的动物便于调查研究，其次是该动物更加适合实验目的和要求；实用性是指该动物来源充分、易于控制、饲养动物的成本和条件要求不高等，再综合实验的需要本次实验选择兔子。
2.1.2 实验试剂
质量分数为20%FBS的DMEM-F12（购自美国Hyclone公司）；体积分数为5% 的CO2；ELISA 试剂盒（购自江苏绿叶生物科技有限公司）； 10% 中性福尔马林溶液（购自南京化学试剂股份有限公司）；60%双蒸水（购自武汉卡诺斯科技有限公司）；HE 染料（购自青岛科创质量检测有限公司）；番红 O 染料（购自天津百伦斯生物技术有限公司）；Western blot检测器（购自南京晓晓仪器设备有限公司）；石膏；及兔子Wnt/β-catenin信号通路相关因子，例如：β-catenin和MMPs（购自杭州华安生物技术有限公司）
2.2造模
为了研究骨关节炎发病的最根本原因和治疗的方法，因此需要我们去构建可靠的小动物模型

。模型的制作可以分为2类：人工诱发模型和自发模型。自发模型是实验动物在自然情况下并没有任何的人为处理导致的炎症。人工诱发模型也就是诱导模型，诱导模型分为：手术方法和非手术方法，手术法包括：关节内手术和关节外手术，关节内手术有：半月板全/部分/根部切除；Hulth法；改良Hulth法；前交叉韧带切除；内侧副韧带切除，还有一种是在关节外进行手术操作：软骨损伤；关节周围肌肉破坏；关节血液循环破坏；关节撞击。而非手术法包括：关节制动和腔内药物注射，关节制动是用石膏固定于伸直位、屈曲位；腔内药物注射的药物有：木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶、尿素酶等。使用最多的腔内注射药物是木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，注入腔内后能够分解细胞基质的蛋白多糖。这个多糖对细胞起到比较好的保护作用。如果这类多糖被破坏将会导致软骨细胞破坏以至于使得软骨降解，因此成为软骨的弹性、退变和硬度重要指标[10]。不同的造模方法有其各自的特点，例如：关节内手术诱导的骨关节炎模型快速、稳定、可重复但会导致早期的炎性递质的释放。关节外手术诱导不会导致关节内结构的破坏和关节内出血，但造模的时间比较长。非手术诱导，如关节制动的有点比较其他造模方法有点较多，不足之处仅仅在于外用固定器的脱落。结合不同的造模方式优点和不足以及本实验自身要求，将选择关节制动法进行造模。
首先对大耳兔进行适应性的喂养 1 周后将其随机分成为 OA 组和正常对照组，每组 20 只。对于正常情况下不对对照组不进行处理，对于 OA 组使用关节制动法，制动法是通过改变应力诱导或加剧关节软骨退变进而建立骨关节炎，制动的时间越长，关节软骨的退变将逐渐加重[12]。具体操作如下：将兔子的毛减至 0.6 厘米左右，将兔子的左后肢膝关节固定于屈曲 40°-45° 位，利用高分子的石膏绷带将其固定于过屈位，石膏距髋关节 3 厘米，距踝关节 2 厘米，并在石膏绷带外面用细铁丝进行缠绕和等待石膏变硬后，将兔子置于笼子中。在造模过程中不定期的驱赶兔子和观察兔子的状态。若发现咬损严重、石膏脱落和关节变的肿胀等一系列的现象，因该立即重新固定兔子的肢膝关节。
在造模后第 3 周后我们不难发现骨关节炎病变程度随着时间成正比，在第 8 周时就出现了严重的骨关节炎外观形状。造模第 8 周后实验人员通过对实验组进行 X 线摄影对该组的影像进行鉴定。确定造模完成后用空气栓塞法[13]处死各组兔并在无菌条件下取造模膝关节软骨组织。
2.3病理学评分
取下实验组和对照组的关节软骨组织，用酶对软骨组织

进行分离得到软骨细胞。将两组的软骨细胞用质量分数为 20%FBS 的 DMEM-F12、温度与兔子的体温一致、体积分数为 5% 的 CO2、饱和湿度的细胞培养箱中常规的原代培养和传代培养。用 10% 中性福尔马林溶液固定后，再用 30% 甲酸加上 10% 中性福尔马林再加 60% 双蒸水组成的 30% 甲酸混合溶液进行脱钙 15d，随后脱水、透明、浸蜡以及包埋制成标准石蜡标本后切成 4 μm 厚度的石蜡片样本，之后将石蜡标本进行常规的 HE 染色和番红 O 染色来进行病理学成模鉴定。等软骨细胞传代培养的正常组和实验组 48 后提取该细胞培养液经过离心处理得到该细胞的上清液，然后再用 ELISA 法检测 Wnt/β-catenin 信号通路相关因子(β-catenin、ADAMTS-4、MMPs)、炎性介质和软骨的机制成分等一系列的蛋白水平。对于染色之后的样本放在普通的光学显微镜下进行观察被染料侵染的细胞质的颜色、软骨细胞的各成分分布情况、细胞的形态和分布等各种情况并进行改良的Mankin 评分[14]。评分和分组标准为：正常对照组通过影像观察，关节表面光滑，关节间隙和软骨的四层结构清晰可见，关节软骨切片显示关节面平整，细胞基质均匀、形态正常，排列整齐以至于潮线完整，被番红 O 正常染色，此时改良 Mankin评分将其评为 0~1 分；实验组中骨关节轻度退变的通过影像观察可见表面模糊，开始有骨赘形成和关节间隙消失，软骨表面有部分细胞固缩且结构紊乱，衬里细胞开始增生偏于一侧导致软骨表面凹凸不平、炎性细胞浸润和开始显现多个潮线，被番红 O 轻度的染色，此时改良 Mankin评分将其评为 2-5 分；实验组中骨关节中度退变的比轻度骨关节稍微更严重点：软骨表面已经凹凸不平、炎性细胞大部分浸润和已经有很多的潮线，软骨细胞逐渐退化导致软骨层变薄，被番红 O 染色的程度比轻度组更加深，此时改良 Mankin评分将其评为 6-9 分；实验组中骨关节重度退变的比中度骨关节稍微更加严重点：关节软骨细胞基本退化以至于骨关节正常结构被完全破坏，细胞的排列杂乱无章，形态也不一致，细胞基质分布也不均匀，潮线几乎完全消失，被番红 O 染色的程度比中度组更加深，此时改良 Mankin评分将其评为 10-14 分。表1是对照组和实验组的评分结果。
2.4细胞因子检测
我们将会使用 ELISA 法对血清中的炎性因子：IL-1β、IL-18和IL-33进行检测。实验组和对照组进行骨关节处进行取血，将其静置半小时左右后进行一刻钟的离心操作后，才将实验组和对照组的血清进行收集等待下一步的实验。简言之：取样、静置、离心和收集血清。
(1) 建立可以与实验组进行对照的标准曲线，其步奏：在做实验之前的 1

5 分钟，根据标准的实验指示将该实验的标准溶液配置好，大概实验时需要至少 3 个。
(2) 往检测器中加入待测的溶液、溶剂和标准的溶液。将标准品加到有被酶包裹板的那个容器，并加到板孔底部尽量不接触孔壁，等到将其加到指定位置后，轻轻的振动是两者混合均匀。为了使待测品稀释五倍：先加入五分之四的样品稀释液，再加待测品五分之一。简称：加样。
(3) 将配套的膜盖上并将其放到与体温相近的保温箱中将近1 小时 30 分钟。简称：温育。
(4) 将浓缩的洗涤液用蒸馏水稀释一定倍数后等待使用。简称：配液。
(5) 待检测完成，首先将检测器中的溶液移除后将其放到专门清洗该容器的机器上并加入已经配置好的洗涤液进行清洗，清洗操作至少三次，并且最后一次应该用滤纸把容器上的液体吸干。简称：洗板。
(6) 除了空白对照组外，实验组和标准组每个孔都应该加入酶的标准试剂。简称：加酶。
(7) 将配套的膜盖上并将其放到与体温相近的保温箱中将近1 小时 30 分钟。简称：温育。
(8) 待检测完成，首先将检测器中的溶液移除后将其放到专门清洗该容器的机器上并加入已经配置好的洗涤液进行清洗，清洗操作至少三次，并且最后一次应该用滤纸把容器上的液体吸干。简称：洗板。
(9) 将每个孔都加入 A 和 B 这两种显色剂，轻轻的摇晃几下使两个显色剂混合均匀后，再将其在避光的条件下放置在与体温相近保温箱中。简称：显色。
(10) 每个孔中都加入终止液，是该反应终止。简称：终止。
(11) 在终止试剂加入后，在 15 分钟内将要完成以下操作，用空白组来调零，再用 450 nm波长的去测定每个孔的吸光度。将其操作完成后再多做几组这样的实验，来保证实验结果的准确性和可靠性。
2.5 β-catenin、OPN 和 MMPs 蛋白的检测
我们将使用蛋白质印迹 (Western blot) 来检测软骨细胞中滑膜细胞的β-catenin、OPN和MMPs的表达情况，其步骤如下：
(1) 提取细胞浆中的蛋白和该细胞核的蛋白；
(2) 对第一步获取的胞浆蛋白和细胞核蛋白进行定量的蛋白测定，简称：蛋白定量；
(3) 电泳；
(4) 转膜；
(5) 用 5 % 的 dried skimmed milk (脱脂奶粉)进行封闭；
(6) 用 5 % 的脱脂奶粉对一抗进行稀释，稀释到适当浓度，使用膜倒贴的方法对该浓度的抗体进行孵育，孵育时的温度为室温时间为 1-3 小时，简称：一抗孵育；
(7) 用 TBST 的方法对第六步所得的成品进行洗涤，每次洗涤时间10 min，共 4-5 次；
(8) 进行第二次孵育并加入一定量的 HRP 对二抗进行标记，孵育时的温度为室温时间为 1-1.5 小时之后操作与第八步中的洗涤一致；
(9) 使用检测器在暗室中对其进行观察。
2.6 统计分析

采用 SPSS 17. 0 进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，采用t进行两组间比较的检验。P < 0. 05 为差异有统计学意义。
3 预测实验结果
3.1 病理检测的预期结果
通过石蜡标本影像观察和染色剂染色的评分结果，将实验组的评分由高到低依次分成：轻度骨关节炎、中度骨关节炎和重度骨关节炎。
3.2 细胞因子检测的预期结果
实验结果的预计，经过使用ELISA 法对血清中的炎性因子 IL-1β 显示。我们可以看出患者的 IL-1β 炎性因子比正常组要高出与多。出数据我们不难发现，在轻度的骨关节炎患者 IL-1β 表达的最高。中度骨关节炎患者和重度骨关节炎患者 IL-1β 表达没有比轻度患者的高。因此该基因在刚刚患有骨关节炎时更加的活跃。而对于 IL-18 和 IL-33 基因表达是随着骨关节炎患者程度加深逐渐增多。细胞培养液的上清液中炎性因子的表达可以看出：正常组中几乎没有炎性因子表达的产物而实验组中炎性因子更加的活跃，表达产物也比正常组要多很多，并随着骨关节炎程度的加深炎性因子表达产物增多，这种表达产物也将逐渐使得骨关节的组织细胞遭到某种程度的破坏。
3.3 β-catenin、OPN和MMPs检测的预期结果
通过Western blot检测发现正常组和实验组在滑膜细胞的胞浆中 β-catenin 都进行了表达，但实验组比对照组中的 β-catenin 更高并且两者的差异具有统计学的意义。正常组的细胞核中没有发现 β-catenin 的表达，但对于实验组的细胞核内有 β-catenin 表达。由此可以简单的推测：正常的滑膜细胞的细胞浆会表达 β-catenin 蛋白且细胞核不会，但被损坏的软骨组织中 β-catenin 蛋白会过表达，在细胞浆中积累等积累到一定值时会向细胞核进行转移，由此Wnt/β-catenin 信号通路被激活。而对于 OPN，在正常的组织中 OPN 表达没有 β-catenin 在正常组织中表达活跃。然而在患者中该基因的表达更加的活跃，这种活跃程度随着骨关节炎患者患病的程度的加深在逐步的加重。
使用该方法对 MMPs 检测显示。在正常的组织中 MMPs 表达也没有 β-catenin 在正常组织中表达活跃。然而在患者中该基因的表达更加的活跃，这种活跃程度随着骨关节炎患者患病的程度的加深在逐步的加重。通过进一步的研究这两者的表达可能是随着 β-catenin 增多也在不断的增多。
4 结 论
OA 是很普遍的骨关节疾病，被认为健康的三大杀手之一。因此，人类高度重视更好的骨关节炎治疗方法的寻找。随着科学技术高度发展，人们将技术与治疗骨关节炎的方式相结合。因此，骨关节炎的治疗方法也得到了快速的发展。
传统骨关节炎治疗方法中针灸治疗效果最为显著。因为针刺通过影响细胞因子、炎性