骨关节炎机制
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关键词 Wnt 蛋白质类 β连环素 骨关节炎 软骨，关节 信号传导 逆转录聚合酶链反应 骨形态发生蛋 白质类 胶原Ⅹ型 基质金属蛋白酶 13
Wnt/ beta -Catenin Signaling in the Pathogenesis of Osteoarthritis
WANG Chaohua, ZHANG Zibo, ZHU Mei, LIU Jun, REN Kaijing, LU Biao, LI Feng’ao, QIU Mingcai Department of Endocrinology, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China Abstract Objective: To investigate the Wnt/β-catenin signaling pathway related proteins and gene expression in the articular cartilage of osteoarthritis (OA) samples from patients undergoing total knee arthroplasty. Methods: The samples of articular cartilage were divided into three groups by using the modified Mankin score including control group, mild OA and moderate OA group. The levels of β-catenin and MMP-13 were detected by immunohistochemistry staining. Total RNA was extracted from articular cartilage tissues. Real Time reverse transcriptase polymerase chain reaction (Real Time RT-PCR) was performed to test the expression of bmp-2, col-10 and mmp-13, and also the expression of β2m was tested for reference. Results: There were 8 cases in control group, 15 cases in mild OA and 27 cases in moderate OA. The result of β-catenin im⁃ munohistochemistry showed negative in control group, 9 positive in mild OA group and 7 positive in moderate OA group. The result of MMP-13 immunohistochemistry showed one positive in control group, 14 positive in mild OA and 21 positive in mod⁃ erate OA group. The results of Real Time RT-PCR showed that the expression levels of bmp-2, col-10 and mmp-13 were sig⁃ nificantly increased in mild OA group (3.01-, 2.89-and 4.04-fold) than that of moderate OA group (P < 0.01). Conclusion: Overexpression of β-catenin in articular chondrocytes leads to the articular cartilage damage and the development of OA. Key words Wnt proteins beta catenin osteoarthritis cartilage, articular signal transduction reverse transcrip⁃ tase polymerase chain reaction bone morphogenetic proteins collagen type Ⅹ matrix metalloproteinase13
Fra Baidu bibliotek
为轻度病变组 36 例次和中度病变组 48 例次。分别提取其总 RNA，逆转录为 cDNA，应用 Real Time RT-PCR 的方法，选用 β2微球蛋白（beta-2-microglobulin，β2m）作为内参，检测骨形态 发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，bmp-2）、Ⅹ型胶原 （typeⅩ collagen，col-10）及 mmp-13 基因的表达水平。β2m 上 游 5′-TGAGTATGCCTGCCGTGTG-3′，下游 5′-AAAGCAAGC AAGCAGAATTTG-3′；bmp-2 上游 5′-GTGGACTTCAGTGACG TGG-3′，下 游 5′-ACCAACGTCTGAACAATGG-3′ ；col-10 上 游 5′-TGCTAGTATCCTTGAACTTGG-3′ ，下游 5′-ACCTTGCT CTCCTCTTACTG-3′ ；mmp-13 上 游 5′-ATGCCATTACCAGTC TCCG-3′，下游 5′-TGCAGCATCAATACGGTTG-3′，以上引物 均由北京奥科生物技术有限公司合成。PCR 扩增反应条件： 95 ℃预变性 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃~56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进 行 35 个 循 环 ，最 后 72 ℃ 延 伸 10 min，β2m、bmp-2、col-10、 mmp-13 退火温度分别为 56 ℃、56 ℃、52 ℃、54 ℃。PCR 扩增 产物的测序也由上述公司完成。Real Time RT-PCR 结果直 接得到各个基因的 Ct 值，用同一标本目的基因的 Ct 值减去β 2m 基因的 Ct 值得出△Ct。用轻度病变组的△Ct 值减去中度 病变组的△Ct 值得出△△Ct，通过 2-△△Ct 法计算出各目的基 因在轻度病变组与中度病变组表达的差异。 1.4 统计学方法 采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量 资料以x ± s表示，计数资料以例表示。轻度病变组△Ct 值与 中度病变组△Ct 值的比较行两独立样本资料 t 检验，免疫组 化结果行χ2检验或确切概率法，以 P < 0.05 为差异有统计学 意义。
484
Tianjin Med J, Jun 2011, Vol 39 No 6
1 对象与方法
1.1 研究对象 研究组：按照 2007 年中华医学会骨科分会 公布的最新骨关节炎诊治指南确定的膝关节炎诊断标准，选 择 2009 年 10 月—2010 年 7 月于天津市天津医院关节中心和 天津市人民医院关节外科行膝关节置换术的骨关节炎患者 的关节软骨标本，共 42 例，其中男 6 例，女 36 例，年龄 50~77 岁，平均（62.88±7.97）岁。研究组患者术前 X 线表现为关节 间隙变窄、甚至消失，关节面硬化变形，关节边缘骨赘形成， 关节软骨下囊性改变，关节失稳。根据影像学资料，研究组 中度病变 5 例，中度偏重病变 20 例，重度病变 17 例。术中大 体病理可见关节软骨组织磨损严重，甚至消失，以内侧为著， 骨骼边缘可见大量骨赘形成。对照组：取自天津医科大学解 剖学教研室无偿提供的膝关节标本，根据肉眼观察及病理评 分 结 果 排 除 退 行 性 变 、类 风 湿 性 关 节 炎 及 肿 瘤 性 病 变 ，共 8 例。 1.2 主要试剂 兔抗人β-catenin 多克隆抗体（美国 Cell Sig⁃ naling 公司）。0.4%胃蛋白酶消化液（北京中杉金桥生物技术 有限公司）。兔抗人 MMP-13 多克隆抗体、5%正常山羊血清 封 闭 液 、生 物 素 化 山 羊 抗 兔 IgG、辣 根 酶 标 记 链 亲 和 素 （SABC）、3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（武汉博士德 生物工程有限公司）。Trizol、M-MLV 逆转录酶、RNA 酶抑制 剂、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、Oligo（DT）、Buffer（美国 Invitro⁃ gen 公司）。SYBR® Green Master Mix（日本 Toyobo 公司）。 1.3 方法 1.3.1 病理学观察 根据情况每例患者及对照组分别取 3~6 个不同病变部位的膝关节软骨标本，所取部位分别为胫骨内 侧、胫骨外侧、股骨内侧髁、股骨外侧髁、股骨后髁、股骨前 髁，软骨已全部磨损的部位未取得标本。所取标本全部以 10%中性福尔马林溶液固定 72 h，于 30%甲酸混合液（30%甲 酸+10%中性福尔马林+60%双蒸水）中脱钙 14 d，常规脱水， 石蜡包埋，5 μm 厚连续切片。分别采用以下 3 种染色方法： HE 染色、番红 O/固绿（SO/FG）染色和阿辛蓝/橙黄 G（AB/OG） 染色，并根据改良的 Mankin 关节软骨病理评分标准进行分级 评定。结构：正常 0 分，表层破坏 1 分，血管翳及表层破坏 2 分，浅层裂隙形成达移行层 3 分，裂隙局限性深达骨质辐射层 4 分，深达骨质钙化层缺损负重区 5 分，全层软骨缺损 6 分。 细胞：正常 0 分，细胞过多、紊乱 1 分，细胞成簇 2 分，细胞少 3 分。SO/FG 染色：正常 0 分，轻度失染 1 分，中度失染 2 分，重 度失染 3 分，完全失染 4 分。潮线的完整性：完整 0 分，不完 整、有血管通过 1 分。总分 0~14 分。正常（0~2 分），轻度病变 （3~7 分），中度病变（8~11 分），重度病变（12~14 分）。 1.3.2 免疫组化 应用免疫组织化学卵白素-生物素复合技 术（Avidin-Biotin complex method，ABC）分别检测软骨细胞中 β-catenin 及 MMP-13 的表达情况。 1.3.3 定量 PCR 标本离体后，快速于无菌条件下分别留取 与病理取材部位相一致处的关节软骨组织，于-80 ℃冰箱保 存备用。每例患者分别选取 2 个标本，根据病理评分结果分
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种退行性骨关 节疾病，传统观点认为 OA 的发病与白细胞介素-1、 肿瘤坏死因子等细胞因子及基质金属蛋白酶 （matrix metalloproteinase，MMP）等蛋白酶类产生过 多有关，但在临床上应用抗炎药物及蛋白酶抑制剂 治疗 OA 并没有取得很好的疗效。近年来的研究发 现，上调的 Wnt/β-catenin 信号转导通路在 OA 的发 病机制中起着重要的作用 。 [1] 本研究旨在探讨 OA
与 Wnt/β-catenin 信号转导通路的关系，并进一步明 确 OA 的发病机制，为 OA 的早期诊断和病情判断提 供参考，也为进一步治疗和预防 OA 提供理论依据。
* 国家自然科学基金资助项目（项目编号：30973040） 作者单位：300052 天津医科大学总医院内分泌科（王超华，张 子博，朱梅，卢飚，李凤翱，邱明才）；天津市人民医院关节外科（刘 军）；天津医院关节中心（任凯晶） △通讯作者 E-mail：meichuqin@yahoo.com.cn
天津医药 2011 年 6 月 第 39 卷 第 6 期
483
doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2011.06.002
论著
Wnt/β-Catenin 信号通路与骨关节炎发病机制的研究 *
王超华 张子博 朱 梅△ 刘 军 任凯晶 卢 飚 李凤翱 邱明才
摘要 目的：观察骨关节炎（OA）行膝关节置换术的患者软骨组织中 Wnt/β-catenin 信号传导通路相关蛋白及基 因的表达情况。方法：关节软骨组织根据改良的 Mankin 关节软骨病理评分标准分为对照组、轻度病变组和中度病变 组。应用免疫组织化学的方法检测软骨细胞中β-catenin 及基质金属蛋白酶（MMP）-13 的表达情况。提取 OA 行膝关 节置换术 42 例患者的关节软骨总 RNA，应用 Real Time RT-PCR 的方法，选用β2微球蛋白作为内参，检测软骨组织中 骨形态发生蛋白（bmp）-2，Ⅹ型胶原（col-10）及 mmp-13 基因的表达情况。结果：病理评分对照组 8 例均正常；研究组 轻度病变组 15 例，中度病变组 27 例。β-catenin 免疫组化结果显示对照组全部为阴性；轻度病变组 9 例阳性，中度病 变组 7 例阳性。MMP-13 免疫组化结果显示对照组 1 例阳性；轻度病变组 14 例阳性，中度病变组 21 例阳性。Real Time RT-PCR 结果显示轻度病变组 bmp-2、col-10 和 mmp-13 的表达水平分别为中度病变组的 3.01、2.89 和 4.04 倍，差 异有统计学意义（均 P < 0.01）。结论：β-catenin 在关节软骨细胞中高表达可能是关节软骨破坏并导致 OA 发展的重要 原因。
Wnt/ beta -Catenin Signaling in the Pathogenesis of Osteoarthritis
WANG Chaohua, ZHANG Zibo, ZHU Mei, LIU Jun, REN Kaijing, LU Biao, LI Feng’ao, QIU Mingcai Department of Endocrinology, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China Abstract Objective: To investigate the Wnt/β-catenin signaling pathway related proteins and gene expression in the articular cartilage of osteoarthritis (OA) samples from patients undergoing total knee arthroplasty. Methods: The samples of articular cartilage were divided into three groups by using the modified Mankin score including control group, mild OA and moderate OA group. The levels of β-catenin and MMP-13 were detected by immunohistochemistry staining. Total RNA was extracted from articular cartilage tissues. Real Time reverse transcriptase polymerase chain reaction (Real Time RT-PCR) was performed to test the expression of bmp-2, col-10 and mmp-13, and also the expression of β2m was tested for reference. Results: There were 8 cases in control group, 15 cases in mild OA and 27 cases in moderate OA. The result of β-catenin im⁃ munohistochemistry showed negative in control group, 9 positive in mild OA group and 7 positive in moderate OA group. The result of MMP-13 immunohistochemistry showed one positive in control group, 14 positive in mild OA and 21 positive in mod⁃ erate OA group. The results of Real Time RT-PCR showed that the expression levels of bmp-2, col-10 and mmp-13 were sig⁃ nificantly increased in mild OA group (3.01-, 2.89-and 4.04-fold) than that of moderate OA group (P < 0.01). Conclusion: Overexpression of β-catenin in articular chondrocytes leads to the articular cartilage damage and the development of OA. Key words Wnt proteins beta catenin osteoarthritis cartilage, articular signal transduction reverse transcrip⁃ tase polymerase chain reaction bone morphogenetic proteins collagen type Ⅹ matrix metalloproteinase13
Fra Baidu bibliotek
为轻度病变组 36 例次和中度病变组 48 例次。分别提取其总 RNA，逆转录为 cDNA，应用 Real Time RT-PCR 的方法，选用 β2微球蛋白（beta-2-microglobulin，β2m）作为内参，检测骨形态 发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，bmp-2）、Ⅹ型胶原 （typeⅩ collagen，col-10）及 mmp-13 基因的表达水平。β2m 上 游 5′-TGAGTATGCCTGCCGTGTG-3′，下游 5′-AAAGCAAGC AAGCAGAATTTG-3′；bmp-2 上游 5′-GTGGACTTCAGTGACG TGG-3′，下 游 5′-ACCAACGTCTGAACAATGG-3′ ；col-10 上 游 5′-TGCTAGTATCCTTGAACTTGG-3′ ，下游 5′-ACCTTGCT CTCCTCTTACTG-3′ ；mmp-13 上 游 5′-ATGCCATTACCAGTC TCCG-3′，下游 5′-TGCAGCATCAATACGGTTG-3′，以上引物 均由北京奥科生物技术有限公司合成。PCR 扩增反应条件： 95 ℃预变性 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃~56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进 行 35 个 循 环 ，最 后 72 ℃ 延 伸 10 min，β2m、bmp-2、col-10、 mmp-13 退火温度分别为 56 ℃、56 ℃、52 ℃、54 ℃。PCR 扩增 产物的测序也由上述公司完成。Real Time RT-PCR 结果直 接得到各个基因的 Ct 值，用同一标本目的基因的 Ct 值减去β 2m 基因的 Ct 值得出△Ct。用轻度病变组的△Ct 值减去中度 病变组的△Ct 值得出△△Ct，通过 2-△△Ct 法计算出各目的基 因在轻度病变组与中度病变组表达的差异。 1.4 统计学方法 采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量 资料以x ± s表示，计数资料以例表示。轻度病变组△Ct 值与 中度病变组△Ct 值的比较行两独立样本资料 t 检验，免疫组 化结果行χ2检验或确切概率法，以 P < 0.05 为差异有统计学 意义。
484
Tianjin Med J, Jun 2011, Vol 39 No 6
1 对象与方法
1.1 研究对象 研究组：按照 2007 年中华医学会骨科分会 公布的最新骨关节炎诊治指南确定的膝关节炎诊断标准，选 择 2009 年 10 月—2010 年 7 月于天津市天津医院关节中心和 天津市人民医院关节外科行膝关节置换术的骨关节炎患者 的关节软骨标本，共 42 例，其中男 6 例，女 36 例，年龄 50~77 岁，平均（62.88±7.97）岁。研究组患者术前 X 线表现为关节 间隙变窄、甚至消失，关节面硬化变形，关节边缘骨赘形成， 关节软骨下囊性改变，关节失稳。根据影像学资料，研究组 中度病变 5 例，中度偏重病变 20 例，重度病变 17 例。术中大 体病理可见关节软骨组织磨损严重，甚至消失，以内侧为著， 骨骼边缘可见大量骨赘形成。对照组：取自天津医科大学解 剖学教研室无偿提供的膝关节标本，根据肉眼观察及病理评 分 结 果 排 除 退 行 性 变 、类 风 湿 性 关 节 炎 及 肿 瘤 性 病 变 ，共 8 例。 1.2 主要试剂 兔抗人β-catenin 多克隆抗体（美国 Cell Sig⁃ naling 公司）。0.4%胃蛋白酶消化液（北京中杉金桥生物技术 有限公司）。兔抗人 MMP-13 多克隆抗体、5%正常山羊血清 封 闭 液 、生 物 素 化 山 羊 抗 兔 IgG、辣 根 酶 标 记 链 亲 和 素 （SABC）、3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（武汉博士德 生物工程有限公司）。Trizol、M-MLV 逆转录酶、RNA 酶抑制 剂、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、Oligo（DT）、Buffer（美国 Invitro⁃ gen 公司）。SYBR® Green Master Mix（日本 Toyobo 公司）。 1.3 方法 1.3.1 病理学观察 根据情况每例患者及对照组分别取 3~6 个不同病变部位的膝关节软骨标本，所取部位分别为胫骨内 侧、胫骨外侧、股骨内侧髁、股骨外侧髁、股骨后髁、股骨前 髁，软骨已全部磨损的部位未取得标本。所取标本全部以 10%中性福尔马林溶液固定 72 h，于 30%甲酸混合液（30%甲 酸+10%中性福尔马林+60%双蒸水）中脱钙 14 d，常规脱水， 石蜡包埋，5 μm 厚连续切片。分别采用以下 3 种染色方法： HE 染色、番红 O/固绿（SO/FG）染色和阿辛蓝/橙黄 G（AB/OG） 染色，并根据改良的 Mankin 关节软骨病理评分标准进行分级 评定。结构：正常 0 分，表层破坏 1 分，血管翳及表层破坏 2 分，浅层裂隙形成达移行层 3 分，裂隙局限性深达骨质辐射层 4 分，深达骨质钙化层缺损负重区 5 分，全层软骨缺损 6 分。 细胞：正常 0 分，细胞过多、紊乱 1 分，细胞成簇 2 分，细胞少 3 分。SO/FG 染色：正常 0 分，轻度失染 1 分，中度失染 2 分，重 度失染 3 分，完全失染 4 分。潮线的完整性：完整 0 分，不完 整、有血管通过 1 分。总分 0~14 分。正常（0~2 分），轻度病变 （3~7 分），中度病变（8~11 分），重度病变（12~14 分）。 1.3.2 免疫组化 应用免疫组织化学卵白素-生物素复合技 术（Avidin-Biotin complex method，ABC）分别检测软骨细胞中 β-catenin 及 MMP-13 的表达情况。 1.3.3 定量 PCR 标本离体后，快速于无菌条件下分别留取 与病理取材部位相一致处的关节软骨组织，于-80 ℃冰箱保 存备用。每例患者分别选取 2 个标本，根据病理评分结果分
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种退行性骨关 节疾病，传统观点认为 OA 的发病与白细胞介素-1、 肿瘤坏死因子等细胞因子及基质金属蛋白酶 （matrix metalloproteinase，MMP）等蛋白酶类产生过 多有关，但在临床上应用抗炎药物及蛋白酶抑制剂 治疗 OA 并没有取得很好的疗效。近年来的研究发 现，上调的 Wnt/β-catenin 信号转导通路在 OA 的发 病机制中起着重要的作用 。 [1] 本研究旨在探讨 OA
与 Wnt/β-catenin 信号转导通路的关系，并进一步明 确 OA 的发病机制，为 OA 的早期诊断和病情判断提 供参考，也为进一步治疗和预防 OA 提供理论依据。
* 国家自然科学基金资助项目（项目编号：30973040） 作者单位：300052 天津医科大学总医院内分泌科（王超华，张 子博，朱梅，卢飚，李凤翱，邱明才）；天津市人民医院关节外科（刘 军）；天津医院关节中心（任凯晶） △通讯作者 E-mail：meichuqin@yahoo.com.cn
天津医药 2011 年 6 月 第 39 卷 第 6 期
483
doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2011.06.002
论著
Wnt/β-Catenin 信号通路与骨关节炎发病机制的研究 *
王超华 张子博 朱 梅△ 刘 军 任凯晶 卢 飚 李凤翱 邱明才
摘要 目的：观察骨关节炎（OA）行膝关节置换术的患者软骨组织中 Wnt/β-catenin 信号传导通路相关蛋白及基 因的表达情况。方法：关节软骨组织根据改良的 Mankin 关节软骨病理评分标准分为对照组、轻度病变组和中度病变 组。应用免疫组织化学的方法检测软骨细胞中β-catenin 及基质金属蛋白酶（MMP）-13 的表达情况。提取 OA 行膝关 节置换术 42 例患者的关节软骨总 RNA，应用 Real Time RT-PCR 的方法，选用β2微球蛋白作为内参，检测软骨组织中 骨形态发生蛋白（bmp）-2，Ⅹ型胶原（col-10）及 mmp-13 基因的表达情况。结果：病理评分对照组 8 例均正常；研究组 轻度病变组 15 例，中度病变组 27 例。β-catenin 免疫组化结果显示对照组全部为阴性；轻度病变组 9 例阳性，中度病 变组 7 例阳性。MMP-13 免疫组化结果显示对照组 1 例阳性；轻度病变组 14 例阳性，中度病变组 21 例阳性。Real Time RT-PCR 结果显示轻度病变组 bmp-2、col-10 和 mmp-13 的表达水平分别为中度病变组的 3.01、2.89 和 4.04 倍，差 异有统计学意义（均 P < 0.01）。结论：β-catenin 在关节软骨细胞中高表达可能是关节软骨破坏并导致 OA 发展的重要 原因。