15-AtCS82基因T—DNA插入突变体筛选和过表达转基因植株的获得

ＡｔＳ ２ｇｎ ｉｅｅｔｉ ｕ ｓ ｆ ｒｂｄｐ ｉ（ ｅ ｌ ｆｆ ｗｅ， ｏ ）ｔｅ ｅｕｔｓｏ ｅｐｅｓ ｎｏ Ａ Ｃ ８ ｅｅｗ ｓ Ｃ ８ ｅ ｅｎｄｆ ｒｎ ｓ ｅ Ａ ａ ｉ ｓ ｓ ｍ，ｅ ， ｏ ｒｐ ｄ，ｈ ｓｌ ｗ ｒｓｉ ｆ ｔＳ ２ｇ ｎ ａ ｉ ｆ ｔｓ ｏ ｏ ｓ ｔ ａ ｌ ｒ ｓｈ ｘ ｏ
第 ３ 卷第 ３ ９ 期
２１ ０ ３年 ６月
湖南 农业 大 学学 报（ 自然 科 学版）
Ｊｕｎ ｌ ｆ ｕ ａ ｒ ｕｔｒｌ ｎｖ ｒｉ （ ｔｒｌ ｃｅｃｓ ｏ ｒａ ｏ ｎｎＡｇｉ ｌ ａ Ｕ ｉｅｓｙ Ｎａ ａ Ｓ ｉｎｅ） Ｈ ｃ ｕ ｔ ｕ
Ｖ ． ９ ＮＯ ３ ｂ１ ． ３
并转化拟南芥哥伦 比亚野生 型（ ｏ） Ｃ１ 的方式 ，获得 了ＡｔＳ ２基 因的过表达转基 因植株 。 Ｃ８
关
键
词： 拟南芥 ；ＡＣ ８ 基因 ；纯合子筛选 ；过表达 ；转基因植株 ｔＳ２
中图分类号 ： ７６ Ｑ ８
Leabharlann Baidu
文献标志码 ： Ａ
文章编 号 ：１０—０２２ １）３０ ５￣ ６ ０７ １３（ ３ —２３０ ０ ０
Ｊ ｕｎ． ２０１ ３
Ｄ０Ｉ１ ． ７ ４ Ｓ ．２ ８２ ３ ０ ２ ３ ： ０ ３ ２ ／ ＲＪ １ ３ ．０１ ．０ ５
Ａｔ Ｓ ２基 因 Ｔ Ｄ Ａ插入突变体筛选和 Ｃ ８ — Ｎ 过表达转基 因植株 的获得
陈锦华 ，郭磊 ，易力雄 ，刘 春林 ，阮颖
（ 湖南农业大学 ａ生物科 学技术学 院；ｂ农学 院，湖南 长沙 ４ ０ ２ ） ． ． １ １８
ｐ ｉ ｅｓ ｒ ｒ ｗｅ ｅ ｕ ｅ ｏ ｃ ｅ ｎ ｈ ｍｏ ｙ ｏ ｓ ｍｕ ａ ｔ ｔ － ｍ ｒ ｓ ｄ ｔ ｓ ｒ ｅ ｏ ｚ ｇ ｕ ｔ ｎ ｓ ｗｉ Ｔ ＤＮＡ ｎ ｅｔｏ ，ａ ｄ ｔ ｅ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｏ ＣＳ ２ ｇ ｎ ｉ ｈ ｉ ｓ ｒｉｎ ｎ ｈ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆ Ａｔ ８ ｅ ｅ ｎ
摘 要 ： ｔＳ２ ＡＣ ８ 是拟南芥 中一个功能未知 的基 因， 推测该基 因可能 与种子油脂合 成代谢 相关。为探 明 ＡＣ ８ 基 ｔＳ２
因的功能 ， 采用 半定量 Ｒ － Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ法对 Ａ Ｃ ８ 因在拟南芥不 同组织（ 、 、 、 ｔＳ ２基 茎 叶 花 果荚） 中的表达情况进行 了分析 ，
似 的功能［ ， 】 这使得人们可以利用拟南芥的生物信 引
息和 Ｄ ＮＡ 资 源 ，通过对 拟南 芥 中 同源 基 因的研究 来 加快 对油 菜基 因组 的研究 。
ＧＧ Ｔ ＡＧＧＣ Ｃ ＴＴ ＣＧ＿ ＝。 ；
分别取生长 ４ 的 Ｃ ｌ ５ ｄ ｏ野生型拟南芥的茎 、叶、
花及生 长 ４ ７ｄ的果荚 ， 、 采用 Ｔｉ ｌ 【Ｊ ｒｏ法 ｌ提取各组织 ｚ ６
Ｃ ８ 一 ／ Ｓ ２ Ａ。 Ｉ Ｓ ２ ＳＣ ８ － 弓 物序 歹 为 ： ８ 一 ， ｒ Ｔ Ｕ ＣＳ ２ Ｓ ５ Ａ ＧＡ ＿
ＧＣＴ ＡＴＴ ＡＡＧＴＴＴＧＴＴＧＴ ＡＣ－ ＣＳ ２ Ａ ， ５ ３； ８－ ＂ＴＣＡＣ
易于转化 、基因组小且遗传信息丰富ｌ ６ Ｊ 等优点 ，加
之 二者 在基 因组 结构 上 有一 定 的保守 性 引，拟南 芥 中 的许 多 功 能 基 因与 油 菜 中 的 同 源基 因具 有 相
ｈ ｇ ｎ ｐ ｄ ｂ ｔｌ ｗ ｎ ｓｅ ｉ ｈ ｉ ｏ ， ｕ ｏ ｉ ｔ ｍ，ｌａ ｎ ｏ ｒ ｉ ｄ ｃ ｔ ｇ ｔ ｅ ｐ ｒ ｃｐ ｔ ｎ ｏ ＣＳ ２ ｇ ｎ ｎ ｓ ｅ ｅ ｅ ｏ ｍｅ ｔ Ｔｈ ｅ ｅ ｆａ ｄ ｆ ｗｅ ， ｎ ｉ ａｉ ｈ ａｔ ｉ ａｉ ｆ ｌ ｎ ｉ ｏ Ａｔ ８ ｅ ｅ ｉ ｅ ｄ ｄ ｖ ｌ ｐ ｎ ． ｒ ｅ
Ｓ Ｈ 文库为基础 ，分析 Ｅ Ｔ序列【 ，并与拟南芥 Ｓ Ｓ ｌ
基 因 比对 ，筛选 得到 一个 同源 性较 高 、预 期与 油脂
使用三引物法 Ｊ ５ 筛选 Ｔ Ｄ Ａ插入纯合突变体 ＿Ｎ （ 以下简称纯合突变体） 基因型的鉴定需要 ３条引物
（Ｐ Ｐ和 Ｂ ） Ｌ 、Ｒ Ｐ ，使 用 Ｔ Ｄ ｒ ｒＤｅｉ ＿ ＮＡ Ｐ ｍｅ ｓ ｉ ｇ网站 （ｔ ：ｓ ｎ１ａ ． ｕｔｎｐｉ ｒ．．ｍ１ ｈｔ／ ｉ ａ． ｌ ｅ ／ ａｒ ｓ ｈ ） ｐ／ｇ ｓｋ ｄ ｄ ｍｅ ２ ｔ 提供 的在 线
发现其在果荚 中的表达量较 高 ，而在茎 、叶 、花 中的表达量 明显偏低 ，推测 ＡＣ ８ ｔＳ ２基 因可 能参 与种 子发育 ；使
用三引物法对 Ｔ Ｄ － ＮＡ捅 入突变体进行纯合子筛选 ，并通过 Ｒ － Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ检测纯合子植株中 ＡｔＳ ２基因 的表达情况 ， Ｃ８ 试验结果证明获得 了稳定遗传 的 Ａ Ｃ ８ 因沉默纯合突变体 ；通过构建 ｐ Ａ Ｉ ３０ ３ Ｓ： Ｓ ２过表达载体 ， ｔＳ ２基 Ｃ ＭＢ Ａ１０－ ５ ： ８ Ｃ
ＣＨＥ Ｊｎ ｈ ａ ， Ｎ ｉ — ｕ ＧＵＯ ｉ ＹＩ — ｉ ｎ ＬＩ Ｃｈ ｎ ｌ ＲＵＡＮ ｎ Ｌｅ ， ｘ ｏ ｇ ， Ｕ ｕ — ｎ ， Ｌｉ ｉ ｒｉ ｇ
（ ． ｏｌ ｅ ｆ ｏ ｃ ｎ ｅ ｎ ｉｔｃ ｎ ｌｇ ； ． ｏｌ ｅ ｆ ｒｎ ｍｙ Ｈ ｎ ｎ ｒ ｕｔ ａ Ｕ ｉｅｓ ｙ Ｃ ａ ｇ ｈ １ １ ８ ａ Ｃ ｌ ｇ Ｂｉｓｉ ｃ ｄ ｏｅ ｈ ｏｏ ｙ ｂ Ｃ ｌ ｇ Ａｇｏ ｏ ， ｕ ａ ｉ ｌ ｒ ｌ ｎｖ ｒ ｔ ｈ ｎ ｓａ ０ ２ ｅ ｏ ｅ ａ Ｂ ｅ ｏ Ａｇ ｃ ｕ ｉ， ４
ｈｏ ｏ ｙｇ ｓｍ ｕｔｎｔｐ ａ ｔｗ ａ ｅ ｔ ｄ ｕ ｉ ｍ ｚ ｏｕ ａ ｌ ｎ ｓｔ ｓｅ ｓｎｇ ＲＴ－ ＰＣＲ，ｔ ｅ ｕｌｓｐ ｏ ｄ ｅ ｏ ｔ ｉ ｎｇ ｏｆｓａ ｅｐｕ ｅ ｍ ｕｔｎｔｗ ｉ Ａｔ ８２ ｈｅ ｒ ｓ ｔ ｒ ｖｅ ｔ ｂ ａｎｉ ｔｂｌ ｒ ｈ ａ ｔ ｈ ＣＳ
ｇ ｎ ｓｌｎ ｅ ．Ａｔ Ｓ ２ ｏ ｅｅ ｐ ｅ ｓｎ ｔａ ｓ ｅ ｉ ｌｎ ｓ ｅｅ ｉ ｃｄ ｅ Ｃ ８ 一 ｖ ｒ ｘ ｒ ｓｉ ｇ ｒ ｎ ｇ ｎ ｃ ａ ｔ ｐ ｗｅｅ ｂ ａ ｎ ｄ ｙ ｏ ｓｒ ｃｉ ｇ ｐＣ ｒ ｏ ｔ ｉ ｅ ｂ ｃ ｎ ｔ ｔｎ ＡＭＢＩ １ ０ － ５ ：Ｃ ８ ｕ Ａ ０ ３ Ｓ ： Ｓ ２ ３
Ｓ ｒ ｅ ｎｇ ｏ ｃ ｅ ｎｉ ｆＴ－ＤＮＡ ｎｓ ｒｉ ｎ ｍ ｕ ａ ｓａ ｄ ｃ ｎｓｒ ｔｏ ｉ ｅ ｔｏ ｔ ｎｔ ｎ ｏ ｔ ｕｃ ｉ ｎ
ｏ ａ ｓｗ ｉｈ Ａ ｔ ｆｐｌ ｎｔ ｔ ＣＳ８ ｖｅ ｘ ｅ ｓ ｄ ２ ｏ ｒｅ ｐｒ ｓ ｅ
Ｃｈｎ ） ｉａ
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｔｈ ｎ ｔ ｎ ｏ Ｃ ８ ｅ ｅ ｉ ａ ｉ ｏ ｓｓ ｉ ｓｉ ｎ ｎ ｗｎ ｂ ｔ ｔｉ ｓ ｐ ｏ ｅ ｏ ｂ ｓ ｏ ｉｔ ｄ ｗｉ ｅ ｄ ｏ ｌ ｓ ｒ ｃ ： ｅ ｆ ｃｉ ｆ ｕ ｏ Ａｔ Ｓ ２ ｇ ｎ Ａｒ ｂ ｄ ｐ ｉ ｔ ｌ ｋ ｏ ， ｕ ｕ ｐ ｓ ｄ ｔ ｅａ ｓ ｃａ ｅ ｔ ｓ ｅ ｉ ｎ ｓ ｌｕ ｉ ｓ ｈ ａ ａ ｏ ｉｍ． ｏ ｉ ｖ ｓｉ ａｅ ｔ ｅ ｆ ｎ ｔｏ ｆ Ｃ ８ ｅ ｅ ｓ ｍｉ ｕ ｎ ｉ ｔ ｅＲＴ Ｐ ｓｕ ｅ ｏ ａ ａｙ ｅ ｔ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆ ｎｂ ｌ ｓ Ｔ ｎ ｅ ｔ ｔ ｈ ｃｉ ｎ ｏ Ｓ ２ ｇ ｎ ， ｅ — ａ ｔ ａ ｉ － ＣＲ ｗａ ｓ ｄ ｔ ｎ ｌｚ ｈ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｇ ｕ Ａｔ ｑ ｔ ｖ
ｙｎ ｒａ ＠ ｔ ｉｃ ｍ ｉｇｕ ｎ ｈ ｍａ ． ｏ ｌｏ
２４ ５
湖南农 业大学学报（ 自然科学 版）
ｈｔ：ｗ ｔ ｌ ｗｗ＿ ｎ Ｘ ． ｍ ｐｌ ｈ ｄ ｂｔ ｎ ｏ
２ １ ６月 ０ ３年
同属十字 花科 的拟 南芥 具有 植株 小 、生长周 期 短 、
表达 水平 ，根 据 Ｔ Ｉ 网站 （ｔ ：ｗ ＡＲ ｈｔ ／ ｗｗ．ａｉｏ ｓ ． ｐ／ ａ ｂｄｐｉ ｒ ｓ ｏｇ上公 布 的拟南 芥 Ａ Ｃ ８ 因 ｃ Ｎ 序列 ， 用 ｒ） ｔＳ２基 Ｄ Ａ 采 Ｐ ｍｅ ｒｍｉ 引物 设 计 软 件设 计 了 １对 引 物 ｉ ｒ ｒＰｅ ｅ ５ ｒ
本课题组 在系统分析油 菜种 子发育 和代谢产
物 转化 过程 的基 础上 ，以开花 后 ２ ０ ｄ和 ３ ５ ｄ的油
的总 Ｒ Ａ， Ｎ 将其反转录为 ｃ Ｎ 以 Ｃ ８－ ／Ｓ ２Ａ Ｄ Ａ， Ｓ２ Ｓ ８－ Ｃ
为引物 ， 进行 Ｐ Ｒ扩增 。 Ｃ 预期 Ｐ Ｒ产 物大小 为 ４２ ｐ Ｃ ３ ｂ。
目前 ，油 菜 已成为 第 大经 济作 物 ，而 菜 籽 ｌ 油 已经 成 为第 二大植 物 油［。油菜 菜 籽油产 量 及其 品质 的提 高 一 直 是 油 菜 育种 工作 者重 点 关 注 的 问
究 的一 项 重要 内容 。 目前 ，关 于植 物脂 肪酸 合成 的 部 位 与 主要 生 化 过程 的研 究成 果 较 多 ，而 对其 分 子调 控机 理 的报道 较少 。甘蓝 型油 菜 为异 源 四倍
题 ，而探寻脂肪酸代谢调控机理是油菜分子育种研
体 ，且生长周期较长 ， 研究难度较高。相 比之下 ，
收稿 １期 ：２ １￣）— ３ ９ ０ ３ ３ １
基金项 目：同家 自然科学基金项 目（１７ ４ ５ ３ ０ １５ ） 作者简 介：陈锦华（９ ９ ） １ ８一 ，女 ，湖南新化人 ，硕士研究生 ，主要从事植物分子生物学研究 ，ｋ ｎ ｂ ｉ２ ＠ｙ ｈ ｏｔｍ． ； 通信作 者 ， ｏ ｇ ａ１２ ａ ｏ ． ｃ ｏ ｎ
１ ２ ２ Ｔ Ｄ Ａ插入 纯合 子的三 引物检 测 ． ． － Ｎ
菜种子作为抑制性消减杂交（ ｐ ｒ ｓ ｎ ｓ ｔ ｃｖ ｓ ｐｅ ｉ ｕ ｒ ｔ ｅ ｕ ｓｏ ｂ ａ ｉ
ｈ ｂｉｉａｏ ， Ｓ 的材料 ，构建 了油 菜种子 发育 中 ｙｒ ｚｔ ｎ Ｓ Ｈ） ｄ ｉ 同化 产物转 化 ２个关键 时期 的 Ｓ Ｈ 文 库Ｌ Ｓ １ 。以该
ｒｃ ｍｂｎｎ ｌ ｍｉ，ｏｌｗｅ ｙ ｒｎｆｒ ｎ ｔ ｒｂｄｐ ｉｔａｉｎ ｆ ｏｕ ｉ ｏｙ ｅ（ ｏ） ｅｏ ｉａ ｔ ａ ｄ ｆｌ ｐｓ ｏ ｄ ａ ｓ ｍｉｇｉ ｏＡ ａ ｉｏ ｓ ｌ ａ ｌ ｂｔ ｏ ｎ ｓ ｈ ａ ｏ Ｃ ｍｂａ ｃｔｐ Ｃ １ ｅ ．
Ｋ ｅ ｏ ｄｓ Ａｒ ｉ ｐｓｓ ｔ ｆａ ｙ ｗ ｒ ： ａｂｄｏ ｉ ｈａ ｎａ； ＣＳ８ ｎｅ ｃ ｅ ｎｉｇ ｍ ｏ ｙｇｏ ｕ ａ ｔ ｖｅ ｘ ｅ ｓｏｎ； ｒｎｓ ｎｉ ａ ｔ ｉ Ａｔ ２ ｇｅ ；ｓ ｒ ｅ ｎ ｈｏ ｚ ｕｓｍ ｔ ｎ ；ｏ ｒｅ ｐｒ ｓ ｉ ｔａ ｇｅ ｃｐｌ ｎ ｓ
合成代谢相关 的拟南芥基因序列 ，命名为 ＡＣ ８ 。 ｔＳ ２
为 了从 分子水 平研 究 Ａ Ｃ ８ ｔＳ ２基 因的功能 ，首 先 需要 获得 ＡｔＳ ２基 因沉默 的纯 合突 变体 和过 表 Ｃ８ 达 转基 因植 株 。笔者 通过对 Ｔ Ｄ ＿ ＮＡ 插 人突变 体 的 筛 选 ，获得 了 １株稳 定遗 传 的 ＡｔＳ ２基 因沉默 纯 Ｃ８ 合 突变 体株 系 ； 通过构 建 ｐ Ａ Ｉ ３０ ３Ｓ：Ｓ ２ Ｃ ＭＢＡ１０－ ５ ： ８ Ｃ 过 表 达载体 ，并转 化拟 南芥 ｒｂｄｐ ｉｔａｉｎ） ａ ｉｏｓ ｌ ａ哥 ｓｈ ａ 伦 比亚野生 型（ ｏ） Ｃ １，获得 了 ＡＣ ８ ｔＳ ２基 因的过表 达 转 基 因植株 ，现将结 果报 道如 下 。