第9章__蛋白质工程中的基因突变方法

3.鸟枪合成突变法 鸟枪合成突变法
用这种方法,可在基因的一个很大 用这种方法 可在基因的一个很大 区域中同时引入多种突变. 区域中同时引入多种突变 首先将这一区域的基因序列分解成 若干可互相黏结的片段,然后合成各种 若干可互相黏结的片段 然后合成各种 所需突变的寡核苷酸,将这些寡核苷酸 所需突变的寡核苷酸 将这些寡核苷酸 与目的基因双链一起退火.一次连接即 与目的基因双链一起退火 一次连接即 得到含各种突变的基因大段序列. 得到含各种突变的基因大段序列
正 链 负链
错配部位
5)将此闭环双链 将此闭环双链DNA纯化 纯化. 将此闭环双链 纯化 6)将纯化的双链闭环 将纯化的双链闭环DNA用大肠杆菌进 用大肠杆菌进 将纯化的双链闭环 行转化,复制 其复制转化产物中含有所 行转化 复制,其复制转化产物中含有所 复制 需的突变基因. 需的突变基因
正链 负链
1.经典的寡核苷酸诱导的定点突变 经典的寡核苷酸诱导的定点突变
大体步骤: 大体步骤 1) 制备含有目的基因 即欲突变的基因) 制备含有目的基因(即欲突变的基因 目的基因 即欲突变的基因 的单链DNA(简称正链). 的单链 简称正链 简称正链
目的基因(正链) 目的基因(正链) 正链
突变点
2) 合成含有所需要突变序列的寡核苷酸引物 这种 合成含有所需要突变序列的寡核苷酸引物.这种 引物中间部分是所需突变序列,与目的基因的欲 引物中间部分是所需突变序列 与目的基因的欲 突变部位错配.其两端部分是互补区 其两端部分是互补区. 突变部位错配 其两端部分是互补区
带有目的基因 寡核苷酸 的DNA
置换后的DNA 置换后的
置换出来的 片段
1. 盒突变
盒突变是这类方法的代表. 盒突变是这类方法的代表 所谓盒,就是指与目的基因的欲突 所谓盒 就是指与目的基因的欲突 变部位相应的、 变部位相应的、由化学合成的一系列 双链寡核苷酸。 双链寡核苷酸。这一系列双链寡核苷 酸可能带有各种可能选用的突变系列。 酸可能带有各种可能选用的突变系列。 当进行突变处理时， 当进行突变处理时，根据实际需要把 各种突变盒插入目的基因中， 各种突变盒插入目的基因中，就象把 盒式录音带插入录音机一样。 盒式录音带插入录音机一样。
破坏嘧啶) 肼(破坏嘧啶 破坏嘧啶
在溴乙啶存在下,限制性酶只切断 在溴乙啶存在下 限制性酶只切断 双链中一条链,在基因中形成单链缺口 在基因中形成单链缺口, 双链中一条链 在基因中形成单链缺口 再用核酸酶稍加扩大缺口,然后采用限 再用核酸酶稍加扩大缺口 然后采用限 制底物(只供应三种或两种核苷酸 只供应三种或两种核苷酸)或 制底物 只供应三种或两种核苷酸 或 用硫取代核苷酸底物的方法,让其 用硫取代核苷酸底物的方法 让其 DNA聚合酶填补缺口 此过程有可能 聚合酶填补缺口,此过程有可能 聚合酶填补缺口 出现错误掺入,从而造成非定点突变 从而造成非定点突变. 出现错误掺入 从而造成非定点突变
带有目的 基因的 DNA
多种寡核苷 酸
置换后的 DNA
置换出来的 片段
2. TAB突变 突变
向目的基因中原有的某些限制 位点处插入多种六核苷酸系列(相当 位点处插入多种六核苷酸系列 相当 于二氨基酸密码子,TAB就是 就是two 于二氨基酸密码子 就是 amino acid bases的意思 在蛋白质 的意思),在蛋白质 的意思 的某些部位插入2个氨基酸 个氨基酸,并不会 的某些部位插入 个氨基酸 并不会 很大地影响立体结构,但却可以影响 很大地影响立体结构 但却可以影响 其功能. 其功能 目前,大量的六核苷酸序列已经 目前 大量的六核苷酸序列已经 商品化. 商品化
（二）寡核苷酸置换的定点突变
上述的寡核苷酸诱导的定点突变只 适用于将蛋白质中的某一氨基酸转变 为预定的另一种氨基酸。 为预定的另一种氨基酸。但如果事先 不能确定转变产物， 不能确定转变产物，需要将每一种可 能的代替氨基酸逐一实验的时候， 能的代替氨基酸逐一实验的时候，就 要求同时进入某一点的多种突变。 要求同时进入某一点的多种突变。 适合这类要求的突变方法， 适合这类要求的突变方法，就是 寡核苷酸置换的定点突变法。 寡核苷酸置换的定点突变法。
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优点
1).可以精确地在基因的预定位置导入任 可以精确地在基因的预定位置导入任 何所需要的突变,并有有效的筛选手段 何所需要的突变 并有有效的筛选手段 可以取得突变基因. 可以取得突变基因 2).对目的基因本身的结构没有任何要求 对目的基因本身的结构没有任何要求, 对目的基因本身的结构没有任何要求 可以直接地用于各种需要突变的基因. 可以直接地用于各种需要突变的基因 3).此法步骤简单 技术成熟 在蛋白质工 此法步骤简单,技术成熟 此法步骤简单 技术成熟,在蛋白质工 程研究中得到广泛的应用. 程研究中得到广泛的应用
按照突变引入的方式， 按照突变引入的方式，定点突 变又可以分为寡核苷酸诱导的定点 变又可以分为寡核苷酸诱导的定点 突变和寡核苷酸置换的定点突变两 突变和寡核苷酸置换的定点突变两 大类。 大类。 （一）寡核苷酸诱导的定点突变 这是一种非常重要的突变方法， 这是一种非常重要的突变方法， 技术非常成熟。 技术非常成熟。
第九章 蛋白质工程中的 基因突变方法学
蛋白质工程的长远目标是创造人们 需要的各种性能优越的人造蛋白质。 需要的各种性能优越的人造蛋白质。 而在目前阶段， 而在目前阶段，则以通过基因突变制 取天然蛋白质的各种人工产物为主。 取天然蛋白质的各种人工产物为主。 蛋白质工程使用的基因突变全部 属于体外突变。按照它们对突变位点 属于体外突变。 确定的程度，可以大致分为定点突变 确定的程度， 和非定点突变两大类。 和非定点突变两大类。
正链
负链
经突变后的目的基因
7) 将复制的混合物分离提纯 测定突变 将复制的混合物分离提纯,测定突变 部位的序列.与预定序列比较 与预定序列比较,符合者 部位的序列 与预定序列比较 符合者 即是所要求的突变基因. 即是所要求的突变基因 8)将符合的突变双链放进寄主细胞进 将符合的突变双链放进寄主细胞进 行表达,合成相应的蛋白质 行表达 合成相应的蛋白质. 合成相应的蛋白质
一. 定点突变
定点突变是对已知序列的基因 或 定点突变是对已知序列的基因(或 是对已知序列的基因 DNA)中任意指定位置进行突变的技 中任意指定位置进行突变的技 其中包括核苷酸的置换、 术.其中包括核苷酸的置换、插入、或 其中包括核苷酸的置换 插入、 删除。 删除。 在蛋白质工程中， 在蛋白质工程中，这项技术主要 应用在需要突变的氨基酸位置可以预 先确定的场合。 先确定的场合。
2. 化学诱变产生非定点突变
化学诱变剂在体内和体外都可以 产生非定点突变: 产生非定点突变 亚硝酸(引起脱氨 引起脱氨) A I 亚硝酸 引起脱氨 G X C U 甲酸(脱嘌呤 脱嘌呤) A N 甲酸 脱嘌呤 G N
C N T N C U 亚硫酸氢钠 用这些试剂处理目的基因,就可 用这些试剂处理目的基因 就可 以发生碱基转变,引起多位点突变 引起多位点突变. 以发生碱基转变 引起多位点突变
2)设法使合成的 设法使合成的DNA双链中 不带突变 双链中,不带突变 设法使合成的 双链中 的正链部分在后代中的比例尽量减少. 的正链部分在后代中的比例尽量减少 而带有突变基因的负链部分在后代中 尽量提高.所采用的方法有 所采用的方法有:偶联双引 尽量提高 所采用的方法有 偶联双引 物法、异源M13双链法、dUMP正链 双链法、 物法、异源 双链法 正链 法等。 法等。
这类方法的过程是， 这类方法的过程是，用带有各种所需 要突变序列的寡核苷酸， 要突变序列的寡核苷酸，在体外直接置换 目的基因中的欲突变部位而实现突变。 目的基因中的欲突变部位而实现突变。置 换过程需要限制性酶切和连接酶连接， 换过程需要限制性酶切和连接酶连接，所 以必须在双链DNA之间进行。寡核苷酸是 之间进行。 以必须在双链 之间进行 双链，目的基因也是双链。 双链，目的基因也是双链。
3)合成双链 合成双链DNA:将突变引物 端磷酸化 与 将突变引物5‘端磷酸化 合成双链 将突变引物 端磷酸化,与 正链混合退火,形成一小段错配的双链 形成一小段错配的双链. 正链混合退火 形成一小段错配的双链
寡核苷酸 引物
正链 正链
寡核苷酸 引物
4)用大肠杆菌 用大肠杆菌DNA聚合酶 延长形成 聚合酶I延长形成 用大肠杆菌 聚合酶 互补链,这条链称为负链.用 这条链称为负链 互补链 这条链称为负链 用T4DNA 连接酶封口. 连接酶封口
二. 非定点突变
非定点突变是指那些不能预先确 定产生突变位点的点突变技术. 定产生突变位点的点突变技术 非定点突变有多项技术.
1.错误掺入 错误掺入 1)局部部位的错误掺入突变 局部部位的错误掺入突变
2) 均匀分布的错误掺入突变
如果非定点突变只分布在基因的 少数部位,就不利于制造各种可能形成 少数部位 就不利于制造各种可能形成 的产物,对蛋白质工程的研究不适宜 的产物 对蛋白质工程的研究不适宜. 对蛋白质工程的研究不适宜 可用性质不同的几种核酸酶处理 目的基因,各种酶作用位点不同,造成 目的基因,各种酶作用位点不同,造成 各种酶作用位点不同 在目的基因的不同位点上形成若干缺 口,然后再限制底物供应或用硫取代核 然后再限制底物供应或用硫取代核 苷酸,让其修复 让其修复,这样就可以在多个位 苷酸 让其修复 这样就可以在多个位 点上进行突变了. 点上进行突变了
2. 对经典方法的改进
现有的改进主要集中在两方面: 现有的改进主要集中在两方面 1)尽量增加突变引物与正链退火后形 尽量增加突变引物与正链退火后形 成局部错配双链的稳定性,使其尽少 成局部错配双链的稳定性 使其尽少 遭受破坏,从而使突变率接近 遭受破坏 从而使突变率接近50%的 的 从而使突变率接近 理论值.所采取的方法有 双引物法、 理论值 所采取的方法有:双引物法、 所采取的方法有 双引物法 退火产物直接转化法. 退火产物直接转化法